Övervakning av levande celler i bioreaktorer är avgörande för produktion av odlat kött. Skalning kräver precisa verktyg för att spåra cellhälsa och tillväxt i realtid. Denna artikel granskar nyckelmetoder, inklusive kapacitanssensorer, Ramanspektroskopi och fluorescens, och belyser deras styrkor och begränsningar för industriella tillämpningar.
Viktiga insikter:
- Kapacitanssensorer: Mäter kontinuerligt livskraftig celldensitet. Effektiv för adherenta celler men känslig för förändringar i cellstorlek.
- Ramanspektroskopi: Spårar metaboliter som glukos och laktat. Idealisk för vattenmiljöer men kräver komplex kalibrering.
- Fluorescens: Övervakar metabolisk aktivitet via NADH/NADPH-signaler. Snabb men påverkas av mediets bakgrundssignaler.
Utmaningar:
- Traditionella tester som Trypan Blue är destruktiva och långsamma.
- Höga celldensiteter och komplexa medier stör optiska metoder.
- Sensorförorening och kalibreringsbehov begränsar effektiviteten.
Att välja rätt metod beror på processkrav, bioreaktorskala och sterilitet. För storskaliga operationer ger ofta en kombination av flera tekniker de bästa resultaten.
Kapacitansbaserade sensorer för livskraftig celldensitet
Hur dielektrisk spektroskopi fungerar
Kapacitanssensorer, även kända som radiofrekvensimpedanssensorer, behandlar levande celler som om de vore små sfäriska kondensatorer. När ett elektriskt fält appliceras på en suspension av celler börjar joner i odlingsmediet och inom cellens cytoplasma att röra sig. De stöter så småningom på det icke-ledande plasmamembranet, vilket orsakar polarisering - en separation av laddningar över membranet [5][6].
htmlHär är nyckeln: endast celler med intakta membran kan polariseras. Döda celler, som saknar intakta membran, kan inte fånga joner och bidrar därför inte till kapacitanssignalen [5][7]. John Carvell, försäljnings- och marknadschef på Aber Instruments Ltd., förklarar detta väl:
"Radiofrekvens (RF) impedans... anses allmänt vara den mest robusta och tillförlitliga metoden för att övervaka levande cellkoncentrationer i däggdjurscellkultur." [5]
Dielektrisk spektroskopi bygger på detta genom att mäta de dielektriska egenskaperna (eller permittiviteten) hos cellsuspensionen över olika frekvenser. Denna process genererar en β-dispersionskurva, som illustrerar hur cellernas förmåga att polariseras minskar när den elektriska fältfrekvensen ökar [6]. En enstaka frekvensavläsning återspeglar ofta den livskraftiga biovolymen - den totala volymen som upptas av levande celler - snarare än bara antalet celler. Större celler bidrar naturligtvis mer till signalen än mindre [5][6].
Dessa principer utgör ryggraden i kapacitanssensortekniken, vilket gör den till ett värdefullt verktyg i bioreaktorsystem.
Användning av kapacitanssensorer i bioreaktorer för odlat kött
Kapacitanssensorer är kompatibla med både engångs- och flergångsbioreaktorsystem. För engångsinstallationer kan engångssensordiskar svetsas in i flexibla filmbaggar eller sättas in genom förmonterade rörportar [5][9]. I rostfria stålsystem ansluts återanvändbara 12-mm sonder via sterila portar [9].
Ett praktiskt exempel kommer från Aachen University, där forskare använde BioPAT ViaMass-systemet i en 20-liters bioreaktor för engångsbruk med gungande rörelse för att övervaka CHO DG44-celler. De uppnådde en stark korrelation (regressionskoefficient på 0,95) mellan kapacitansavläsningar och total cellvolym [5]. På liknande sätt använde Xpand Biotechnology i Nederländerna Aber-biomassasensorer i deras Scinus-cellexpansionssystem för att spåra mesenkymala stamceller (MSCs) odlade på mikrobärare vid en densitet av 60 g/L. Sensorerna spårade effektivt tillväxtprofiler över volymer från 150 mL till 1 liter, med resultat som stämde väl överens med offline-referensmätningar [5].
För produktion av odlat kött utmärker sig kapacitanssensorer när de arbetar med adherenta celler på mikrobärare. Till skillnad från optiska metoder, som kan ha svårt med solida bärare, kan kapacitanssensorer tränga igenom dessa strukturer. Denna förmåga gör dem särskilt användbara för att övervaka förankringsberoende celler, en hörnsten i odlat kötttillverkning [8].
Styrkor och svagheter hos kapacitanssensorer
Kapacitanssensorer erbjuder kontinuerlig, realtidsdata utan de kontaminationsrisker eller förseningar som är förknippade med manuell provtagning. De är för närvarande de enda kommersiellt tillgängliga onlineverktygen för att bedöma cellviabilitet i industriella bioprocesser [7]. Medan traditionella offline-metoder som trypanblåttester har en relativ felmarginal på cirka 10%, kan kapacitansfrekvensskanning minska detta fel till mellan 5,5% och 11% [6].
Det sagt, dessa sensorer har sina begränsningar.Enkel-frekvensmätningar kan inte skilja mellan en ökning i cellantal och en ökning i cellstorlek. Till exempel, om celler växer avsevärt i diameter under en körning - oavsett om det beror på stress eller dödsfasen - kan signalen felaktigt representera det faktiska cellantalet om inte multifrekvensskanning används [6]. Dessutom kan förändringar i suspensionsmediet, såsom tillsatser av näring eller utspädningar, orsaka tillfälliga "dippar" i data som inte återspeglar verkliga förändringar i biomassa [5]. I bioreaktorer med gungande rörelse kan sensorn tillfälligt stöta på gasutrymmet, vilket kräver avancerade filteralgoritmer för att undvika signalstörningar [5].
Dessa faktorer är avgörande vid finjustering av övervakning av levande celler för produktion av odlat kött.
Spektroskopimetoder för analys av levande celler
Raman- och NIR-spektroskopi
Raman-spektroskopi använder oelastisk ljusspridning från en 785 nm laser för att generera ett molekylärt fingeravtryck, vilket möjliggör samtidig mätning av metaboliter som glukos, laktat, glutamin och ammonium. Å andra sidan detekterar NIR-spektroskopi (800–2,500 nm) optiska absorptioner från övertoner och kombinationsband [10][12][13][14]. Ramans minimala känslighet för vatten gör det idealiskt för vattenmiljöer som cellkulturer, medan NIR:s höga vattenkänslighet - på grund av den starka O–H-sträcksignalen - kan dölja kritiska biokemiska data [10][12][14].
I mars 2017, Lonza Biologics jämförde NIR, Raman och 2D-fluorescens i 15 mL miniatyrbioreaktorer (ambr™-system). De fann att Raman var mest tillförlitlig för att mäta laktat och glukos, medan NIR presterade bättre för att förutsäga glutamin- och ammoniumjonsnivåer [10][11].
I april 2022 integrerade forskare vid Sartorius Stedim Biotech en in-line Raman-flödescells i den cellfria skördeströmmen av en CHO-cellperfusionsprocess. Med hjälp av en HyperFluxPRO Raman-spektrometer med en 785 nm laser uppnådde de automatiserad glukosåterkopplingskontroll, och bibehöll koncentrationer på 4 g/L och 1,5 g/L med en variation på ±0,4 g/L under flera dagar [13]. J.Lemke från Sartorius Stedim Biotech noterade:
"Resultaten visar den höga potentialen hos Ramanspektroskopi för avancerad processövervakning och kontroll av en perfusionsprocess med en bioreaktor och skaloavhängig mätmetod." [13]
I maj 2011 använde Bristol-Myers Squibb en in-line Raman-sond i 500-liters bioreaktorer för att övervaka flera parametrar, inklusive glutamin, glutamat, glukos, laktat, ammonium, livskraftig celldensitet (VCD) och total celldensitet (TCD). Spektra samlades in varannan timme med ett Kaiser Optical Systems RamanRXN3-instrument, vilket visar Ramans förmåga att spåra näringsökningar och metabolitminskningar under tillsatser i storskalig tillverkning [14].
Medan Raman- och NIR-spektroskopi ger detaljerade kemiska insikter, erbjuder fluorescens- och UV-Vis-metoder kompletterande perspektiv på cellulär metabolism och biomassa.
Fluorescens- och UV-Vis-spektroskopi
UV-Vis-spektroskopi mäter ljusabsorption eller spridning för att uppskatta total biomassa [16]. Denna enkla och allmänt använda metod har dock svårt att skilja mellan livskraftiga och döda celler och blir mindre exakt vid högre celldensiteter [16].
Fluorometri, som är mer känslig än UV-Vis, fokuserar på specifika intracellulära markörer som NADH och NADPH, indikatorer på metabolisk aktivitet. In situ-fluorometri använder 366 nm ultraviolett ljus för att excitera NADH/NADPH, som sedan fluorescerar vid cirka 460 nm [16].Veer Pramod Perwez förklarar:
"Den enda kontinuerliga övervakningsstrategin som hittills utvecklats och som ger information om cellpopulationens biokemiska eller metaboliska tillstånd är in situ-fluorometri." [16]
Inom produktion av odlat kött, där realtidsdata är avgörande, ger fluorescens snabb återkoppling på metaboliska förändringar, medan UV-Vis erbjuder ett ekonomiskt sätt att uppskatta biomassa. Fluorescens kan spåra metaboliska skift och upptäcka substratuttömning i realtid genom att övervaka NADH-nivåer. Till exempel, i en studie mätte 2D-fluorescens ammoniumkoncentrationer med en RMSECV på 0,031 g/L, vilket överträffade både Raman och NIR i miniatyrbioreaktorinställningar [11]. Dessutom kan automatiserade mikrofluidiska plattformar kombinera ljusfältmikroskopi (för att mäta total cellkoncentration) med fluorescensdetektion med hjälp av propidiumjodid, vilket bestämmer cellviabilitet på bara 10.3 minuter [15].
Jämförelse av olika spektroskopimetoder
När man jämför dessa tekniker har varje unika styrkor för övervakning av bioreaktorer. Raman utmärker sig för sin förmåga att förutsäga glukos, laktat och antikroppstitrar, tack vare sin molekylära fingeravtryck och låga störningar från vatten [10][11]. NIR, trots sin känslighet för vatten, är mer effektiv för övervakning av glutamin och ammonium [10][12]. Fluorescens ger detaljerad insikt i metabolisk aktivitet och livskraft, medan UV-Vis förblir ett enkelt och kostnadseffektivt val för att uppskatta total biomassa [16].
Multivariat analys förbättrar tolkningen av komplexa spektra, vilket möjliggör samtidig övervakning av flera analyt [10][13][14]. För produktion av odlat kött beror valet av rätt spektroskopimetod på de metaboliter som ska övervakas, bioreaktorns skala och om engångs- eller flergångssystem används. Dessa tekniker möjliggör tillsammans exakt cellövervakning, där Ramans kompatibilitet med vattenmiljöer och dess multi-analyt kapacitet gör den särskilt attraktiv för storskaliga operationer [13][14].
Mammaliacellkultur - Raman som ett sätt att övervaka &och kontrollera uppströms bioprocesser
sbb-itb-ffee270
Avancerade metoder för cellfysiologi och livskraft
Förutom spektroskopi erbjuder banbrytande tekniker djupare insikter i cellfysiologi och livskraft.
FTIR för övervakning av cellviabilitet och apoptos
FTIR-spektroskopi använder molekylära vibrationer i proteiner, lipider och kolhydrater för att upptäcka näringsstress och tidig apoptos, båda kritiska markörer för försämrad cellhälsa i odlade köttbioreaktorer.
En metod, ATR-FTIR (Attenuated Total Reflection), analyserar spektral variabilitet i högvågsnummerområden för att skilja mellan friska och näringsbristiga celler. I maj 2024, forskare vid Dxcover Ltd.anställde en ATR-FTIR-plattform utrustad med engångs-interna reflektionsenheter (IREs) för att övervaka CHO-cellernas hälsa. Genom att använda Principal Component Analysis (PCA) kunde de framgångsrikt skilja friska celler från näringsbristiga i PC-utrymmet. Plattformen uppnådde imponerande multi-output R²-värden nära 0,98 för glukos och mjölksyra, vilket erbjuder insikter i realtid om cellernas livskraft [17]. Eftersom ansamling av mjölksyra kan leda till celldöd, möjliggör denna övervakning i realtid snabba ingripanden för att upprätthålla cellhälsan.
Moderna FTIR-system är designade med engångs-IREs eller nedsänkta sonder för direkt integration i bioreaktormiljöer. Denna uppsättning ger inte bara data i realtid utan minskar också risken för kontaminering [17].Som framhävs i Frontiers in Bioengineering and Biotechnology:
"Spektroskopibaserade teknologier är väl lämpade som PAT-metoder eftersom de är icke-destruktiva och kräver minimal provberedning." [17]
Genom att utöka dessa kapaciteter, adresserar multifrekvens kapacitansskanning begränsningarna hos enfrekvensmetoder.
Multifrekvens kapacitansskanning
Medan enfrekvens kapacitanssensorer är användbara för att mäta livskraftig cellvolym (VCV), har de svårt att skilja mellan förändringar i cellstorlek och cellantal. Denna begränsning blir särskilt problematisk under apoptos, när celldiametrar ofta ökar [18].Multi-frekvens kapacitansskanning löser detta problem genom att mäta permittivitet över ett intervall på 50–20,000 kHz, fånga β-dispersionskurvan för att noggrant bedöma livskraftiga cellkoncentrationer oavsett storleksvariationer [18].
I oktober 2019 använde forskare vid Sartorius Stedim Biotech en Aber Instruments FUTURA pico-sond för att övervaka DG44 CHO-celler i 250 mL bioreaktorer. Genom att tillämpa Ortogonal Partial Least Squares (OPLS) modellering på 25 diskreta frekvenser minskade de VCC-förutsägelsefel till bara 5,5% till 11%, en betydande förbättring jämfört med 16% till 23% felfrekvenser som sågs med enfrekvensmätningar [18]. Modellen spårade effektivt cellkoncentrationer som översteg 10 miljoner celler/mL och identifierade snabbt avvikelser orsakade av utspädning och matningsförändringar, med felmarginaler på 6,7% till 13.2% [18].
Den karakteristiska frekvensen (fC), som indikerar punkten där cellulär polarisering är halvfärdig, förändras baserat på cellstorlek och polariserbarhet. Detta ger en ytterligare markör för fysiologiska förändringar, särskilt under celldödsfasen när morfologin genomgår betydande transformationer [18]. Som Analytical and Bioanalytical Chemistry förklarar:
"Påverkan av VCC och celldiameter på permittivitetssignalen är inte urskiljbar med en frekvensmätning." [18]
Jämförelse av analytiska metoder för övervakning av levande celler
Jämförelse av analytiska metoder för övervakning av levande celler i bioreaktorer
Detta avsnitt tar en närmare titt på viktiga analytiska metoder som används för övervakning av levande celler i odlade köttbioreaktorer, baserat på de avancerade tekniker som tidigare diskuterats.
Att välja den bästa metoden innebär att balansera noggrannhet, hastighet och praktisk användning. Varje teknik erbjuder unika styrkor, oavsett om det handlar om att spåra livskraftig celldensitet, övervaka metabolisk aktivitet eller upprätthålla sterilitet i engångssystem.
Kapacitansbaserade sensorer är för närvarande det enda kommersiellt tillgängliga online-alternativet anpassat för livskraftövervakning [7].Dessa sensorer mäter livskraftig cellvolym genom att detektera polariseringen av celler med intakta membran i ett alternerande elektriskt fält. Medan system med en enda frekvens kan ha problem med noggrannheten när cellstorlekar varierar, förbättrar multifrekvensskanning avsevärt precisionen och uppnår felmarginaler på 5,5%–11% [18].
Spektroskopiska metoder - såsom Raman-, NIR- och fluorescensspektroskopi - erbjuder en mer omfattande bild av metabolisk aktivitet genom att spåra flera parametrar tillsammans med biomassa. Dessa metoder är icke-invasiva, vilket gör dem idealiska för engångsbioreaktorer där sterilitet är kritisk. Dock medför de utmaningar: spektroskopiska system kräver omfattande kalibrering med kemometriska modeller och innebär ofta högre initiala kostnader jämfört med kapacitansprober.
FTIR-spektroskopi är särskilt effektiv för att upptäcka tidiga tecken på apoptos och näringsstress genom molekylär vibrationsanalys. Dock begränsar dess starka vattenabsorption dess användbarhet för kontinuerlig in-line-övervakning i vattenmiljöer [7]. Istället fungerar FTIR bäst som en at-line-metod, särskilt när den kombineras med multivariat analys för realtidsövervakning av metaboliter.
Jämförelsetabell för analytiska metoder
| Metod | Realtidskapacitet | Bioreaktorkompatibilitet | Kalibreringsbehov | Viktiga begränsningar |
|---|---|---|---|---|
| Kapacitanssensorer | Ja (In-line/On-line) | Hög (Omrörd, Gungande, SUBs) | Låg till måttlig | Känslig för gasbubblor och förändringar i cellstorlek/morfologi |
| Ramanspektroskopi | Ja (In-line) | Måttlig (Kräver probport) | Hög (Kemometri) | Höga utrustningskostnader; komplex dataanalys |
| NIR-spektroskopi | Ja (In-line/At-line) | Hög | Hög (Multivariat) | Känslighet för vattenstörningar och medieändringar |
| Fluorescens | Ja (In-line) | Hög | Måttlig | Bakgrundsfluorescens från media; fotoblekning |
| FTIR | Ja (At-line) | Måttlig | Hög | Stark vattenabsorption begränsar in-line användning i vattenbaserade medier |
För produktion av odlat kött, där precision och tillförlitlighet är icke-förhandlingsbara, är det avgörande att matcha analytiska metoder till specifika processkrav för att uppnå optimal prestanda i bioreaktorer.Plattformar som
Slutsats och rekommendationer
Att välja rätt analytisk metod innebär att balansera processkrav med faktorer som skala, kostnad och regulatoriska krav. Ditt val kommer att bero på viktiga överväganden som om dina celler är adherenta eller anpassade för suspension, hur ofta övervakning behövs och hur mycket invasivitet som kan tolereras samtidigt som steriliteten bibehålls [1]. Med de betydande celldemanderna för odlad köttproduktion [1] är precision i övervakningen icke-förhandlingsbar.
Viktiga faktorer för att välja analytiska metoder
Realtidsövervakning bör vara en högsta prioritet.Online-system möjliggör insamling av data in situ utan att ta bort prover, vilket gör dem mer effektiva och mindre benägna för fel jämfört med offline-metoder, som är arbetsintensiva och riskerar kontaminering [3][1]. För storskaliga bioreaktorer - upp till 2 000 liter eller mer - är icke-invasiva tekniker som Raman eller NIR-spektroskopi särskilt användbara. Dessa metoder är reagensfria och kan spåra flera parametrar, såsom glukos, laktat och aminosyror, samtidigt [1][3]. Denna multivariata kapacitet minskar inte bara övervakningskostnaderna utan upprätthåller också den sterila, livsmedelsklassade miljön som behövs för att uppfylla regleringskrav [19].
Känslighet och dynamiskt omfång är lika viktiga vid analys av komplexa biologiska medier.Luminescensbaserade tester erbjuder generellt högre känslighet än fluorescens- eller absorbansmetoder [2]. Under tiden genererar avancerade spektroskopiska tekniker komplexa dataset som ofta kräver maskininlärning eller kemometriska verktyg för korrekt analys [3][1]. För en enklare lösning är kapacitansbaserade sensorer effektiva för att övervaka cellviabilitet.
Skalbarhet och efterlevnad av regler är avgörande för kommersiell produktion. Sensorer i dessa miljöer måste tåla högtemperatursterilisering, minimera läckage och fungera under längre perioder utan behov av omkalibrering. Automatiserade, bildbaserade spårningssystem kan också tillhandahålla tidsstämplad, revisionsklar dokumentation, vilket är avgörande för regulatoriska inlämningar till organ som FDA och EMA [4].Dessa krav understryker vikten av att skaffa rätt utrustning från specialiserade leverantörer.
Effektivisera utrustningsanskaffning med Cellbase
Med tanke på de tekniska och regulatoriska komplexiteterna är det avgörande att hitta rätt analytisk utrustning. Allmänna laboratorieplattformar saknar ofta den expertis som är anpassad för den odlade köttindustrin.
Vanliga frågor
Vilka är fördelarna med att använda kapacitanssensorer i bioreaktorer för produktion av odlat kött?
Kapacitanssensorer ger ett realtids, icke-invasivt sätt att mäta livskraftig cellbiomassa i bioreaktorer. De levererar exakt och tillförlitlig data utan att avbryta processen, vilket gör dem till ett utmärkt val för att spåra celltillväxt och hälsa.
Dessa sensorer fungerar sömlöst över system av alla storlekar, från småskaliga installationer till stora engångsindustriella bioreaktorer. Denna flexibilitet förbättrar processhantering, minimerar beroendet av offlineprovtagning och effektiviserar produktionsarbetsflöden.Genom att erbjuda detaljerade insikter i cellaktivitet spelar kapacitanssensorer en nyckelroll i att förfina bioprocesser, särskilt för odlat köttproduktion.
Vilka är fördelarna med Raman-spektroskopi för att övervaka cellmetaboliter i bioreaktorer?
Raman-spektroskopi möjliggör realtids, icke-invasiv spårning av viktiga cellmetaboliter direkt inom bioreaktorer. Denna metod eliminerar behovet av att ta ut prover, vilket avsevärt minskar risken för kontaminering. Den kan samtidigt mäta en rad föreningar, såsom glukos, laktat, ammonium och produkttitrar, vilket gör den till ett effektivt verktyg för förlängda processer som perfusionskörningar.
Jämfört med andra metoder levererar Raman-spektroskopi ofta högre precision för viktiga metaboliter som glukos och laktat. Den kan till och med överträffa tekniker som nära-infraröd (NIR) och 2D-fluorescens under vissa förhållanden.Till skillnad från traditionella offline-metoder, såsom HPLC eller kolorimetriska tester, fungerar Ramanspektroskopi kontinuerligt, vilket minskar tids- och resursanvändningen samtidigt som cellkulturens integritet bevaras.
Inom produktion av odlat kött utmärker sig Ramanspektroskopi på grund av dess kompatibilitet med kompakta bioreaktorer och dess förmåga att tillhandahålla tillförlitliga, kalibreringsfria mätningar. För de som behöver Raman-baserade övervakningsverktyg,
Vilka är utmaningarna med att använda optiska metoder i bioreaktorer med hög celldensitet?
I miljöer med hög celldensitet står optiska metoder inför utmaningar som ökad ljusspridning och medieturbiditet, vilket kan förvränga mätningarna.Att lägga till komplexiteten, ansamlingen av celldebris kan försvaga signaler och orsaka icke-linjära svar, vilket gör det ännu svårare att uppnå exakta avläsningar.
Dessa problem är särskilt problematiska i bioreaktorer, där förhållandena ständigt förändras och är intrikata. För att hantera dessa begränsningar och bibehålla pålitlig övervakning kan mer sofistikerade analytiska tekniker krävas.
