Jos knockout ei paranna määriteltyä prosessiominaisuutta, se on vain muokkaus, ei käyttökelpoinen solulinja.
Bioprosessi-insinööreille, soluviljelytieteilijöille ja viljellyn lihan T&K-tiimeille artikkelin pääkohta on yksinkertainen: Aloitan pullonkaulasta, asetan läpäisy/hylkäyskynnykset ennen muokkausta, sitten rakennan työnkulun mitattavan tuotantotuloksen ympärille, kuten lyhyempi kaksinkertaistumisaika, suspensiokasvu tai pintaproteiinin poisto. Artikkeli tekee myös selväksi, että poolitason muokkaustiedot ovat hyödyllisiä oppaan sijoittamisessa, mutta julkaisukelpoiseen knockoutin tarvitaan kloonitason genotyyppi, proteiinin menetyksen tiedot, sukulinjan tarkistukset ja monipassainen prosessitestaus (usein sisältäen primaariset vs. kuolemattomat solulinjat).
Heinäkuun 2024 tapaus Ivy Farmilta yhdisti NF2 knockout sian ja naudan myoblasteissa ja rasvaperäisissä kantasoluissa lyhyempiin kaksinkertaistumisaikoihin, tuen suspensiokulttuurille ja sukulinjamerkkien säilyttämiseen.Mutta artikkeli ei pidä sitä universaalina. Tarvitsen silti laji-, linja- ja kohdespesifistä validointia ennen kuin siirrän muokatun kloonin eteenpäin.
Mitä artikkeli kehottaa tekemään:
- Määrittele muokkaustavoite prosessitermein, ei kustannustermein
- Aseta kynnysarvot etukäteen kasvulle, keskeytyskunnolle, merkkien säilymiselle ja kulun vakaudelle
- Valitse kohdegeeni vasta tarkistettuasi reitin roolin, linjavaikutuksen ja turvallisuuteen liittyvät riskit
- Suunnittele oppaat konstitutiivisia koodaavia eksoneita vastaan ja tarkista vanhemman lokus PCR:llä ja Sangerilla ensin
- Käytä luovuttajavapaita työnkulkuja RNP-toimituksella mahdollisuuksien mukaan rajoittaaksesi editorin altistusaikaa
- Käsittele irtotavara-altaita varhaisena seulontana, ei knockoutin todisteena
- Vahvista bialleelinen menetys, ja tarkista sitten proteiinin puuttuminen
- Vahvista klooni vastaavien vanhempien tai vain Cas9, ei-sgRNA kontrollien kanssa
- Vapauta vain linjat, jotka läpäisevät neljä kerrosta: muokkauksen identiteetti, molekyylinen seuraus, solutoiminto ja tuotantokunto
Muutama tekninen seikka erottuu.Artikkeli huomauttaa, että villityypin SpCas9 voi sietää 3-5 epäsopivuutta, , minkä vuoksi off-target -arviointia ei voi jättää jälkikäteen tehtäväksi. Se myös osoittaa, että 17-18 bp lyhennetyt oppaat voivat vähentää off-target -aktiivisuutta jopa 500-kertaisesti ilman merkittävää laskua on-target -suorituskyvyssä. Ja koska ilman luovuttajaa tapahtuva korjaus antaa usein sekamuotoisia indelsejä, en voi olettaa, että "muokattu" tarkoittaa "null" - lukukehyksessä olevat alleelit voivat silti säilyttää toimintonsa.
Missä koin artikkelin hyödyllisimmäksi, on sen kurinalaisuus: pelkkä genotyyppi ei riitä, pelkkä nopea kasvu ei riitä, ja yhden passagen suspensiotiedot eivät riitä. Knockout-linja on merkityksellinen vain, jos se säilyttää linjaidentiteetin, pysyy vakaana vähintään neljässä passagessa kolminkertaisena, ja toimii edelleen samassa viljelymuodossa ja tiheydessä, jota se kohtaa tuotannossa.
Tämä on artikkelin loppuosan kehys: siirry pullonkaulasta, muokkaa suunnittelua, kloonaa näyttö, tee julkaisupäätös sekoittamatta näitä vaiheita keskenään.
Geenien poisto -työnkulku viljellyille lihasolulinjoille
Valitse kohdegeeni ja valitse oikea muokkausstrategia
Kartoitus ominaisuudelle kohdistettavaan reittiin tai säätelysolmuun
Kun muokkaustavoite on selvä, seuraava askel on jäljittää tuotannon pullonkaula tiettyyn säätelysolmuun. Hidas kaksinkertaistumisaika tai heikko suspensiokasvu liittyy usein määriteltyyn reittisolmuun, mikä esittää merkittäviä haasteita viljellyn lihan skaalaamiselle, kuten Hippo, RAS, WNT/β-kateniini tai NOTCH [1].
Se kuulostaa yksinkertaiselta paperilla. Käytännössä se harvoin on. Geeni, joka tukee kasvua yhdessä ympäristössä, voi olla välttämätön selviytymiselle tai erilaistumiselle toisessa.Ennen kuin sitoudut kohteeseen, tarkista todisteet lajeista ja solutyypeistä, joista välität. Tarkastele, onko geenin toiminta redundantti vai ei-redundantti, ja varmista, että toiminnan menetys ei vahingoita myogeenista tai adipogeenista potentiaalia, genomista vakautta tai mitään lopputuotteen turvallisuuteen liittyvää ominaisuutta [1].
Arvioi ehdokaskohteet olettamatta, että mikään geeni olisi yleisesti sopiva
NF2 - joka koodaa Merlin-proteiinia - on hyvä esimerkki knockout-kohteesta viljellyn lihan tutkimuksessa. Ivy Farm Technologies osoitti, että NF2 knockout vähensi kaksinkertaistumisaikaa ja tuki suspensioadaptaatiota sian ja naudan linjoissa samalla kun säilytti linjamerkit [1]. Koska NF2 sijaitsee Hippo-, RAS-, WNT/β-kateniini- ja NOTCH-signaalireittien risteyksessä, yksi knockout voi muuttaa useita kasvureittejä kerralla ilman moninkertaista editointia [1].
MSTN (myostatiini) on toinen kohde, joka tulee usein esiin, erityisesti kun tavoitteena on parantaa lihassolujen tuottoa. Solusyklin säätelijät, kuten RB1 ja TP53 , esiintyvät myös monimutkaisissa strategioissa, jotka on rakennettu lisäämään proliferaatiokapasiteettia. Mutta universaalia kohdetta ei ole olemassa. Geeni, joka toimii yhdessä lajissa tai solutyypissä, tarvitsee silti erillisen validoinnin toisessa. Sama muokkaus voi antaa erilaisen fenotyypin tai tuoda mukanaan epävakautta. Jos sinulla ei ole tietoja edessäsi olevasta linjasta, älä oleta, että tulos siirtyy [1].
Vertaa knockout- ja knockdown-menetelmiä, multiplex-editointia ja gain-of-function-lähestymistapoja
| Editointistrategia | Milloin käyttää | Pääasiallinen rajoitus | Vaadittu näyttö |
|---|---|---|---|
| Yhden geenin knockout | Poistaaksesi pysyvästi negatiivisen säätelijän (e.g. , NF2, MSTN), joka suoraan rajoittaa kasvua tai suspensioadaptaatiota [1] | Mahdollisuus välttämättömien toissijaisten toimintojen peruuttamattomaan menetykseen | Vahvistus elinkelpoisuuden ja erilaistumisen ei-välttämättömyydestä kohdelinjassa [1] |
| Multiplex knockout | Kun päällekkäisiä reittejä on tukahdutettava samanaikaisesti (e.g. , RB1, TP53, ja RAS yhdistelmät) [1] | Kohonnut riski genomiselle epävakaudelle ja kumulatiivisille off-target-vaikutuksille [1] | Synergististen vaikutusten data ja perusteellinen off-target-seulonta kaikissa editoiduissa lokuksissa [1] |
| Knockdown (RNAi/siRNA/CRISPRi) | Kun geeni on välttämätön tai osittainen vähennys riittää ominaisuuden saavuttamiseen [1] | Usein ohimenevä; vaatii jatkuvaa toimitusta tai vakaan shRNA-integraation | Annos-vastesuhteen data osoittaa, että osittainen vähennys saavuttaa kohdefenotyypin [1] |
| Gain-of-function (CRISPRa tai knock-in) | Kasvua edistävän reitin aktivoimiseksi tai uuden kyvyn lisäämiseksi [1] | Monimutkaiset insertointityönkulut; onkogeenisen transformaation tai metabolisen kuormituksen riski [1] | Varmistus siitä, että lisääntynyt ilmentyminen ei estä erilaistumispotentiaalia [1] |
Käytä tätä vertailua muokkausstrategian määrittämiseen ennen oppaan suunnittelun aloittamista.Jos geeni on välttämätön tai jos tarvitsemasi muutos on asteittainen eikä täydellinen poisto, knockdown tai CRISPRi antaa tiukemman hallinnan. Multiplex-editointi on järkevää vain, kun yksittäisen geenin tiedot osoittavat, että lisätty monimutkaisuus on sen arvoista [1][2].
Kun muokkausluokka on kiinnitetty, suunnittele opas-RNA:t täydelliseen toiminnan menetykseen.
sbb-itb-ffee270
Suunnittele opas-RNA:t todelliseen geenin aktiivisuuden menetykseen
Vahvista viitesekvenssi, transkriptin rakenne ja varianttiprofiili
Aloita geenimallista, älä opassekvenssistä. Opassuunnittelu tulisi aloittaa vasta, kun olet suorittanut kohteen valinnan ja vahvistanut vanhempilinjan sekvenssin.
Käytä oikeaa laji-spesifistä viitegenomia. Kartoit sitten täydellisen transkriptin rakenteen: eksonirajat, koodaavan sekvenssin alku ja loppu sekä kaikki anotetut isoformit. Sen jälkeen vahvista itse vanhempilinja.Jos opas ohittaa konstitutiivisen eksonin, toiminnallinen isoformi voi silti säilyä.
PCR-monista vanhempilokus, Sanger-sekvensoi ampliconi ja vertaa sekvenssikutsuja eri passagien välillä vahvistaaksesi aloitussekvenssin. Käytä ICE:tä merkitäksesi olemassa olevat variantit tai polymorfismit. Kun aloituslokus on vahvistettu, lajittele oppaat lukukehyksen siirtymän todennäköisyyden ja off-target-profiilin.
perusteella. Lajittele opaspaikat lukukehyksen siirtymän todennäköisyyden ja alhaisen off-target-riskin perusteella
Kun geenimalli on vahvistettu, keskity oppaan valinnassa konstitutiivisiin koodaaviin eksoniin. Nämä ovat eksonit, jotka ovat läsnä jokaisessa annotoidussa isoformissa, joten muokkaukset siellä todennäköisemmin häiritsevät kaikkia asiaankuuluvia transkriptejä.
Off-target-riski on yhtä tärkeä. Villityypin SpCas9 voi sietää kolme-viisi väärin kohdistusta, erityisesti PAM:sta etäällä olevissa kohdissa.Joten opas, jolla on vahva ennustettu kohdepistemäärä, voi silti aiheuttaa tahattomia leikkauksia, erityisesti klonaalisen laajentumisen jälkeen.
Yksi yksinkertainen tapa vähentää tätä riskiä on lyhentää opasta 17–18 bp:iin. Tämä voi vähentää kohteen ulkopuolisia muokkaustapahtumia jopa 500-kertaisesti ilman merkittävää kohdetarkkuuden heikkenemistä [2]. Käytännössä opas, jolla on 70% kohde-efektiivisyys ja puhdas kohteen ulkopuolinen profiili, on yleensä parempi lähtökohta kuin opas, jolla on 90% efektiivisyys ja useita korkean riskin ennustettuja kohteita.
Tämän luokituksen tulisi suoraan vaikuttaa alla olevaan nukleaasiin valintaan.
Valitse muokkausjärjestelmä, joka sopii knockout-tavoitteeseen
Muokkausjärjestelmä muokkaa oppaan suunnittelua yhtä paljon kuin kohdegeeni. Ilman luovuttajaa tehtävässä knockout-työssä viljellyissä lihassolulinjoissa päävaihtoehdot ovat alla.
| Muokkausjärjestelmä | DSB vaaditaan | Tyypillinen knockout-mekanismi | Oppaan suunnittelun vaikutukset | Paras käyttö |
|---|---|---|---|---|
| SpCas9-nukleaasi | Kyllä | Kehyksen siirtymäindelit NHEJ-menetelmällä | 20 bp opas + NGG PAM; korkea off-target-riski | Vakio knockout vankkoihin primääri- tai kuolemattomiin solulinjoihin |
| Hi-Fi Cas9 -variantit | Kyllä | Kehyksen siirtymäindelit NHEJ-menetelmällä | 20 bp opas + NGG PAM; kapeampi off-target-riski | Kun off-target-riski on kohonnut |
| Cas12a (Cpf1) | Kyllä | Kehyksen siirtymäindelit NHEJ-menetelmällä | T-rikas PAM, kuten TTTN; luo porrastettuja leikkauksia | AT-rikkaat lokukset tai useiden kohteiden moninkertainen knockout |
Moniin luovuttajattomiin knockout-tehtäviin viljellyissä lihassolulinjoissa, SpCas9-nukleaasi 17–18 bp lyhennetyllä oppaalla on vankka lähtökohta.Korkean tarkkuuden variantit ovat järkeviä, kun kohteen ulkopuolinen maisema on täynnä. Cas12a sopii hyvin, kun lokus on AT-rikas tai kun yksi transfektio tarvitsee häiritä useita geenejä kerralla.
Pääasia on yksinkertainen: sovita järjestelmä tavoitteeseen sen sijaan, että käyttäisit oletuksena eniten käyttämääsi alustaa. Tämä valinta asettaa ohjesäännöt ja muokkaa luovuttajavapaata knockout-työnkulkua ja klooniseulaa, jotka seuraavat.
Suorita luovuttajavapaa knockout-työnkulku ja seulonta klooneille oikein
Suorita luovuttajavapaa työnkulku muokkausjäljityksellä
Kun opas ja nukleaasi on lukittu, seuraava vaihe on luovuttajavapaa toimitus ja vaiheittainen klooniseulonta.
Ennen kuin otat käyttöön mitään nukleaasia, varmista emolinjan aitous. Tallenna laji, kudoslähde, passagenumero ja karyotyyppi tai STR-profiili. Tämä aloitustieto antaa sinulle selkeän vertailukohdan kaikelle, mitä seuraa.
Toimitusta varten RNP (ribonukleoproteiini) kompleksit - esikoottu Cas9-proteiini ja sgRNA - ovat vahvasti suositeltavia plasmidi- tai virusmuotojen sijaan [2]. Yksinkertaisesti sanottuna, RNP-toimitus pitää editorin solun sisällä vähemmän aikaa, mikä vähentää matalan taajuuden off-target-leikkausten riskiä [2]. Transfektion jälkeen anna soluille riittävästi aikaa toipua ennen rikastusvaihetta. Rikastus voi lisätä muokattujen solujen osuutta poolissa, mutta se on valinnainen ja se tulisi kirjata joka tapauksessa [1].
Donorittomassa knockout-työnkulussa kaikki korjaus tapahtuu end-joiningin kautta. Tämä on tärkeää, koska kaikki indelit eivät anna null-alleelia. Kehyksessä olevat mutaatiot - indelit, jotka ovat tarkkoja kolmen emäsparin kerrannaisia - voivat jättää lukukehyksen ehjäksi ja saattavat säilyttää proteiinin toiminnan [1]. Joten genotyypin seulonnan on osoitettava null-alleeli ja tarvittaessa bialleelinen menetys, ei vain "muokkaus tapahtui".
Alla oleva taulukko näyttää säilyttämisen arvoiset tiedot jokaisessa vaiheessa, jotta muokkaushistoria pysyy jäljitettävissä.
| Vaihe | Vaaditut tiedot |
|---|---|
| Vanhempien todentaminen | Laji, kudoslähde, passagenumero, karyotyyppi/STR-profiili |
| Opasmuotoilu | gRNA ID, sekvenssi ja pituus |
| Toimitus | Nukleaasi tyyppi, toimitusmuoto (RNP/plasmidi), transfektioparametrit |
| Massapoolin seulonta | ICE/TIDE pisteet, frameshift-indelien prosenttiosuus |
| Klooninen eristys | Eristysmenetelmä (FACS tai rajoittava laimennus), klooni ID, levykartta |
| Genotyypin validointi | Alleelispesifinen sekvensointi, bialleelisen menetyksen vahvistus |
| Toiminnallinen soveltuvuus | Kaksinkertaistumisajan tiedot, pintamerkkien ilmentyminen, suspensiosoveltuvuus |
Päätä, milloin massapoolit ovat hyödyllisiä ja milloin tarvitaan kloonilinjoja
Massamuokatut poolit ovat hyödyllisiä, kun tarvitset nopeita tuloksia.Ne toimivat hyvin opas-RNA:n tehokkuuden arvioinnissa, varhaisen kasvun vertailussa ehdokaskohteiden välillä ja korkean läpimenon kohdevalidoinnissa ilman, että käytetään viikkoja klonaaliseen eristykseen. Vuonna 2023 Ivy Farm Technologiesin tutkijat käyttivät sian myoblastialtaita , jotka oli transfektoitu Cas9:llä ja sgRNA:lla kohdistettuna NF2 -geeniin, arvioidakseen knockout-tehokkuuksia allastasolla Sanger-sekvensoinnin ja ICE-analyysin avulla ennen siirtymistä klonaaliseen eristykseen [1].
Mutta siinä on yksi ongelma. End-joining antaa sinulle sekoitetun populaation: villityyppisiä soluja, heterotsygoottisia muokkauksia, frameshift-muutoksia ja in-frame-alleeleja kaikki samassa altaassa. Mikä tahansa fenotyyppi, jonka mittaat, on keskiarvo tuosta sekoituksesta, ei puhdas knockout-lukema. Siksi bulkki-allas ei voi tukea luotettavaa knockout-väitettä [1].
| Ominaisuus | Laajasti muokatut poolit | Yhden solun johdannaiset kloonit |
|---|---|---|
| Nopeus | Korkea (päiviä) | Matala (viikoista kuukausiin) |
| Genotyypin tarkkuus | Matala (populaation keskiarvo) | Korkea (määritellyt alleelit vahvistettu) |
| Kloonaalinen vaihtelu | Peittyy populaation keskiarvolla | Näkyvä; mahdollistaa parhaiten toimivan linjan valinnan |
| Seulontataakka | Matala | Korkea |
| Soveltuvuus | Kohteen löytö, oppaan sijoitus, varhaiset kasvututkimukset | Prosessikehitys, proteiinin menetyksen validointi, sääntelyllinen vapautus |
Siirry yhden solun kloonaukseen, kun prosessikehitys tarvitsee määritellyn genotyypin.Kloonin kasvun aikana laajenna sukulinjaa säilyttävissä olosuhteissa ja seuraa vanhempien markkereita [1].
Seulo genotyyppi, proteiinin menetys ja toiminnallinen fenotyyppi vaiheittain
Seulonta toimii parhaiten vaiheittaisena työnkulkuna kuin yhtenä suurena läpikäyntinä.
- Vaihe 1 on irtolokuksen tarkistus. PCR-monista kohdealue ja analysoi se Sanger-sekvensoinnilla ICE-purkamisella. Tämä antaa sinulle yleisen editointitehokkuuspisteen ja indel-jakauman, mikä on yleensä riittävä päättämään, kannattaako kloonien eristäminen.
- Vaihe 2 ratkaisee kloonitasoiset alleelit. Kun kloonit on eristetty, amplicon-sekvensointi (NGS) tai alleelispesifinen Sanger voi osoittaa, kantaako kukin klooni bialleelista menetystä vai onko yksi alleeli säilynyt kehysten sisäisenä varianttina.
- Vaihe 3 tarkistaa proteiinin menetyksen.Genotyyppi yksinään ei todista toiminnan menetystä. Katkaistu proteiini voi silti säilyttää jonkin verran aktiivisuutta. Western blot tai virtaussytometria antaa suoraa näyttöä proteiinin puuttumisesta.
- Vaihe 4 testaa muokkaustavoitteeseen liittyvän fenotyypin: kaksinkertaistumisaika, suspensioadaptaatio tai tietty ominaisuus, jota knockoutin oli tarkoitus muuttaa. Tämän lukeman on pysyttävä vakaana ennalta asetetun passausikkunan aikana [1] [2].
Alla oleva taulukko näyttää, mitä kukin seulontamenetelmä voi kertoa sinulle - ja mitä se ei voi.
| Menetelmä | Mitä se määrittää | Rajoitukset |
|---|---|---|
| Sanger + ICE-analyysi | Pool-tason indel-taajuus ja frameshift-jakauma | Ei voi ratkaista spesifisiä alleeliyhdistelmiä yksittäisissä soluissa |
| Amplicon-sekvensointi (NGS) | Korkean resoluution alleeli-identiteetti; off-target-sivustojen havaitseminen | Korkeammat kustannukset; pidempi käsittelyaika |
| Digitaalinen PCR (ddPCR) | Tarkka editointitaajuuden tai kopioluvun kvantifiointi | Vaatii spesifisen koettimen suunnittelun kohdetta kohden |
| Western Blot / Kohdennettu proteomiikka | Proteiinitason kohteen menetys | Puoli-kvantitatiivinen; vaatii validoidun vasta-aineen |
| Virtaussytometria | Pinta- tai solunsisäinen proteiinin menetys; linjamerkkien säilyminen | Vaatii korkealaatuisia laji-validoituja vasta-aineita |
| Monipolven kasvuassay | Kaksinkertaistumisajan vakaus ja tuotantokyky | Aikaa vievä; vähintään neljä polvea tilastollisen pätevyyden saavuttamiseksi |
Tiimeille, jotka siirtyvät laboratoriosta tuotantoon, solulinjojen skaalauskustannusten ymmärtäminen eri bioreaktorijärjestelmissä on kriittinen seuraava askel.
Vertaa aina muokattuja kloonilinjoja vastaavaan emolinjaan vain Cas9, ei sgRNA -kontrolli. Tämä kontrolli auttaa erottamaan muokkaukseen liittyvät vaikutukset transfektiosta ja viljelystressistä ennen prosessiin sopivuuden validointia.
Vahvista knockout viljellyn lihan prosessiin sopivuuden ja vapautuksen osalta
Vahvista muokkauksen identiteetti, molekyylinen seuraus, solutoiminto ja tuotantokyky
Kun kloonigenotyyppi ja proteiiniseulonnat on tehty, seuraava vaihe on vapautusvalidointi. Tässä vaiheessa validoidaan vain ne linjat, jotka jo täyttävät vapautuskriteerit. Vapautuspaketin tulisi kattaa neljä tarkistusta: muokkauksen identiteetti, molekyylinen seuraus, solutoiminto ja tuotantokyky.
Muokkauksen identiteetti vahvistetaan kohdelokuksen PCR-monistuksella, jota seuraa Sanger-sekvensointi ja ICE-analyysi.Tämä osoittaa, onko kloonilla kehitysvaiheessa frameshift- tai bialleelinen knockout [1].
Seuraavaksi tarkista proteiinikato ja linjan säilyminen virtaussytometrialla CD29, CD56 ja CD90. Tämä vahvistaa kohdeproteiinin menetyksen ja osoittaa, että solu on säilyttänyt linjaidentiteettinsä editointityönkulun aikana [1].
Jos nämä linjamerkit ovat edelleen läsnä, siirry erilaistumiseen. Solutoiminnan validointi käyttää BODIPY -värjäystä adipogeenisille linjoille ja myotubien fuusioindeksiä myogeenisille linjoille [1].
Vasta sen jälkeen sinun tulisi testata, toimiiko linja edelleen prosessiolosuhteissa. Tuotantokunto tulisi arvioida suspensioviljelmässä.Triploidit Erlenmeyer-pullon kasvukäyrät, jotka suoritetaan vähintään neljän passagen ajan, ovat hyödyllisiä täällä, koska ne voivat paljastaa kasvuvikoja, jotka ilmenevät myöhemmin eikä välittömästi [1][2].
Mittaa tärkeät ominaisuudet käyttämällä vastaavia vanhempilinjaisia kontrolliryhmiä
Kunkin validointikehyksen testin tulisi olla suoritettu vastaavaa vanhempilinjaista kontrollia vastaan, joko villityyppisillä soluilla tai Cas9-only, ilman sgRNA-poolia. Ilman tätä vertailukohtaa on vaikea sanoa, johtuuko havaittu muutos itse knockoutista vai editointiin liittyvästä stressistä.
Missä prosessi sitä vaatii, lisää stressi- ja vakaustarkastukset julkaisupakettiin. Elinkelpoisuus korkean leikkausvoiman tai ammoniakkikokeen jälkeen voi toimia prosessiin liittyvänä mittarina. Genominen vakaus voidaan tarkistaa karyotyypityksellä tai kohdennetulla NGS:llä ennustetuissa off-target-kohteissa.
Tee tarkoituksenmukainen julkaisupäätös
Kloonin tulisi edetä vain, jos se ylittää ennalta määritellyt kynnykset muokkausidentiteetin, molekyylivaikutuksen, solutoiminnan ja tuotantokelpoisuuden osalta, vahingoittamatta identiteettiä, genomista vakautta tai prosessin suorituskykyä.
| Validointitaso | Todistetyyppi | Määritys / Menetelmä | Kontrolli | Hyväksymiskriteeri | Päätös |
|---|---|---|---|---|---|
| Muokkaa identiteettiä | Alleelin karakterisointi | PCR + Sanger-sekvensointi + ICE-analyysi | Vanhempien villityyppi | Kehyksen siirtymä tai bialleelinen knockout vahvistettu | Jatka / Älä jatka |
| Molekyylinen seuraus | Proteiinin menetys; linjan säilyminen | Virtaussytometria (CD29, CD56, CD90) | Vain Cas9-allas | Kohdeproteiinin menetys; linjan merkit säilytetty | Jatka / Älä jatka |
| Solutoiminto | Differentoitumispotentiaali | BODIPY-värjäys tai myotubefuusioindeksi | Vastaava vanhempilinja | Säilynyt tai parantunut differentoitumispotentiaali | Jatka / Älä jatka |
| Tuotantokyky | Suspensiokasvun vakaus | Kaksinkertaistumisaika ja elinkyky useiden passagien aikana | Vanhempien kontrolli | Vakaa, lyhentynyt kaksinkertaistumisaika suspensiossa | Jatka / Älä jatka |
| Prosessin stressinsietokyky | Elinkyky stressin alla | Elinkykyanalyysi korkean leikkausvoiman tai ammoniakkikäsittelyn jälkeen | Standardi mediakontrolli | Korkea elinkyky prosessiin liittyvän stressin alla | Jatka / Älä jatka |
| Genominen vakaus | Off-target turvallisuus | Karyotyypitys tai kohdennettu NGS ennustetuilla off-target paikoilla | Vanhempien villityyppi | Ei hyväksymättömiä off-target mutaatioita tai translokaatioita | Jatka / Älä jatka |
CRISPR KO vs CRISPR KI -kokeilu käyttäen CRISPR-Cas9:tä
Johtopäätös: Yhdistä muokkauksen onnistuminen tuotannon merkitykseen
Validoinnin jälkeen viimeinen kysymys on, parantaako muokkaus tuotantoa.Kultivoidun lihan ohjelmassa geenin poisto on säilyttämisen arvoinen vain, jos se tuottaa mitattavan tuotantohyödyn - ei vain vahvistettua muokkausta [1].
NF2-tapaus osoittaa, miksi genotyyppi on tarkistettava yhdessä proteiini-ilmentymän, linjan identiteetin ja kasvutietojen kanssa ennen kuin linja arvioidaan sopivaksi. Tämä on ero karakterisoidun kloonin ja linjan välillä, jolla on vain genotyypin muokkaus.
Silti prosessikonteksti voi muuttaa tulosta. Testaa klooni samassa väliaineessa, viljelymuodossa ja solutiheydessä, joita se kohtaa tuotannossa, ei vain löytöviljelyssä. Tämä tarkoittaa suorituskyvyn tarkistamista väliaineen koostumuksen, suspensiomuodon ja passagestabiilisuuden osalta ennen kuin vapautuspäätös tehdään.
Vain kloonit, jotka läpäisevät kaikki neljä vapautustasoa, ovat valmiita vapautettaviksi.
UKK:t901>
Miksi pelkkä genotyyppi ei riitä?
Pelkkä genotyyppi ei riitä. Viljellyn lihan tuotannossa suorituskyky riippuu geneettisen potentiaalin, prosessiehdot, ja solutilan muisti.
välisestä vuorovaikutuksesta.Geenieditointi voi korjata joitakin rajoituksia, mutta se ei korvaa tarkkaa prosessinhallintaa. Kasvatusalusta voi tarjota ulkoisia vihjeitä, mutta nämä vihjeet eivät pysyvästi aseta solutilan muistia. Ja kun signaalit poistetaan, ne eivät voi estää transkriptionaalista kohinaa palaamasta.
Siksi onnistunut tuotanto riippuu kaikkien kolmen osan yhteistyöstä: geenisuunnittelu, kasvatusalustan optimointi, ja bioreaktorin sovitus.
Milloin minun pitäisi käyttää poolia kloonien sijasta?
Käytä pooleja geenin poiston suunnittelun ja prosessikehityksen alkuvaiheissa.Ne antavat sinun arvioida muokkauksen kokonaisvaikutusta nopeammin sekapopulaatiossa, mikä auttaa suuren läpimenon seulonnassa ja varhaisessa validoinnissa.
Poolit myös vähentävät harhan tai fenotyyppisen ajautuman riskiä, joka voi ilmetä, kun luotat liian aikaisin yhteen klooniin.
Mistä tiedän, että knockout on tuotantovalmis?
Knockout on tuotantovalmis, kun muokattu viljelty lihassolulinja pysyy geneettisesti ja fenotyyppisesti vakaana pitkän passauksen ajan, samalla kun se säilyttää jatkuvasti korkean elinkelpoisuuden ja myogeenisen toiminnan tai proliferaation.
Sen on myös sovittava prosessivaatimuksiisi. Tämä voi sisältää suspensiomukautuksen tai lyhyemmät kaksinkertaistumisajat seerumittomissa olosuhteissa. Geenimuokkaukset, väliaineen koostumus ja bioreaktorin yhteensopivuus on testattava yhtenä järjestelmänä, ei erillisinä osina.
