Jos solujen kylvö on alussa epätasaista, perfuusio ei myöhemmin korjaa sitä. Bioprosessi-insinööreille ja viljellyn lihan T &K-tiimeille asennuksen on suoritettava neljä tehtävää kerralla: sovittaa kammio telineeseen, pitää piiri suljettuna ja steriilinä, vaiheistaa kiinnitys ennen suurempaa virtausta ja seurata telineen tasoisia signaaleja, kuten TMP, virtaus, pH, ja sisään-ulos liuennut happi.
Tiivistäisin artikkelin näin: määrittele ensin kudos ja teline, sitten rakenna bioreaktori sen tavoitteen ympärille. Paksummille rakenteille kuin 1 cm, perfuusio on tarpeen hapen ja ravinteiden kuljetuksen hallitsemiseksi. Jakaisin myös prosessin kahteen selkeään vaiheeseen: staattinen tai erittäin matalavirtauskiinnitys ensin, sitten kirjattu virtauksen nousu viljelyä varten. Tämä yksi valinta voi vähentää varhaista huuhtoutumista ja helpottaa vikojen jäljittämistä myöhemmin.
Jos tarvitset vain lyhyen version, tässä se on:
-
Aloita kohteesta, ei laitteistosta
Kudostyyppi, laji, tukirakenteen huokoisuus, kanava-asettelu ja paksuus asettavat rajat kammion suunnittelulle ja perfuusiopolulle. -
Jaa ajo kahteen vaiheeseen
Ensin tarttuminen. Sitten lisää virtausta vaiheittain, kun ankkurointi on paikoillaan. -
Sovita perfuusio tukirakenteen geometriaan
Putkimaiset tukirakenteet sopivat luminaaliseen virtaukseen. Levymaiset muodot saattavat tarvita sisäistä ja ulkoista virtausta. Monimutkaiset 3D-muodot tarvitsevat usein monipolkuista perfuusiota. - Valitse kylvö tukirakenteen avoimuuden ja solujen tarttumisen mukaan Staattinen viipyminen sopii monille kiinnittymistä vaativille soluille. Matalavirtausperfuusio voi parantaa tunkeutumista huokoisiin tukirakenteisiin, mutta huono ajoitus voi johtaa huuhtoutumiseen.
- Lue teline, ei pelkästään silmukkaa Painehäviön nousu, korkeampi TMP, alhaisempi virtaus tai muutos sisään-ulos DO:ssa voi viitata likaantumiseen, tukkeutuneisiin kanaviin tai huonoon hapen toimitukseen ennen kuin kudosvaurioista tulee ilmeisiä.
Bioreaktorin uudelleensolutus: 4-vaiheinen asennusprosessi viljellylle lihalle
Ei-ihmisen kädellisen keuhkojen desolutus & Uudelleensolutus l Protokollan esikatselu
Nopea vertailu
| Alue | Mihin keskittyisin | Pääasiallinen riski, jos jää huomaamatta |
|---|---|---|
| Kohteen määrittely | Kudos, laji, tukirakenteen paksuus ja huokoisuus | Väärä kammio tai virtausmuotoilu |
| Kiinnitysvaihe | Staattinen tai erittäin matala virtaus | Varhainen solujen huuhtoutuminen |
| Perfusiovaihe | Portaittainen virtaus, paine ja leikkausnopeuden nousu | Irtoaminen, tukkeutuminen, huono massansiirto |
| Kylvömenetelmä | Viipyminen vs matalavirtaus perfuusio | Vain pinnallinen peitto tai heikko säilyvyys |
| Seuranta | TMP, flux, pH, sisään-ulos DO | Nekroottisten alueiden tai likaantumisen myöhäinen havaitseminen |
Joten sen sijaan, että käsittelisin uudelleensolutusta yhtenä viljelyvaiheena, käsittelisin sitä sarjana: tavoitteen määrittely, kammion sovitus, kontrolloitu kylvö, vaiheittainen perfuusio ja tukirakenteen tason seuranta.
1. Valitse bioreaktorin muoto ja rakenna suljettu perfuusiojärjestelmä
Sovita kammion suunnittelu tukirakenteen geometriaan
Kammion valinnan tulee vastata tukirakenteen geometriaa, huokoisuutta ja kohdekudoksen paksuutta. Tämä valinta vaikuttaa väliaineen toimitukseen, kylvön pääsyyn ja steriiliin seurantaan.
Levymaisille tukirakenteille käytä kammioa, joka tarjoaa vakaan virtauksen tukirakenteen pinnan yli. Putkimaisille tukirakenteille aseta järjestelmä perfusoimaan suoraan luumenia, sisääntulo- ja ulostuloaukot kohdistettuna putken akseliin. Paksuille tai elinmuotoisille tukirakenteille käytä perfuusioon perustuvia kammioita tai sisäistä monireittiperfuusiota, jotta keskiosa pysyy syötettynä eikä nekroottisia alueita muodostu [1].
Kammiossa tulisi myös olla omistetut portit:
- solujen injektointiin kylvön aikana
- medianäytteenottoon viljelyn aikana
- anturikoettimen asettamiseen
Jos tarvitset optista seurantaa, valitse kammio- ja tukimateriaalit, jotka eivät vääristä lukemia [1].
Kammion geometria asettaa myös rajat käytettäville virtausjärjestelmille. Jos kammio ja tukirakenne eivät sovi hyvin yhteen, perfuusiovaihtoehdot kapenevat nopeasti seuraavassa vaiheessa. Kun kammio sopii tukirakenteeseen, säädä virtaus kudoksen ympärille sen sijaan, että säätäisit sitä laitteiston ympärille.
Suunnittele steriiliä kokoonpanoa ja tilanvaihtoa varten
Suljettu perfuusiojärjestelmä tarvitsee tukikammion, pumpun, mediavaraston, kaasunvaihtoyksikön ja steriilit liittimet. Kokoa piiri laminaarivirtakaapin alla ja käytä steriilejä liittimiä pitämään silmukka suljettuna käytön ja tilanvaihdon aikana. Modulaariset järjestelmät auttavat tässä, koska niiden avulla voit vaihtaa kylvö- ja viljelytilojen välillä avaamatta piiriä.
Miten Cellbase tukee laitteiden hankintaa
sbb-itb-ffee270
2. Aseta virtauksen dynamiikka tasaiselle kylvölle ja elinkelpoiselle kudoksen kasvulle
Nosta virtausnopeutta, painetta ja leikkausta vaiheittain
Kun kammio on koottu ja tukirakenne on paikoillaan, älä aloita täydellä viljelyvirtauksella. Aloita alimmalla virtauksella, joka silti ylläpitää perfuusion, ja lisää sitä sitten hallituissa vaiheissa. Tämä antaa soluille aikaa kiinnittyä ja levitä ennen kuin ne kohtaavat enemmän leikkausta.
Jos virtaus on liian alhainen, ravinteiden kuljetus tukirakenteen ytimeen heikkenee. Jos se on liian korkea, solut voivat irrota ennen kuin ne muodostavat vakaita kontakteja.
Seuraa kalvopaineen (TMP) ja virtauksen muutoksia jokaisessa vaiheessa. TMP:n nousu yhdessä virtauksen laskun kanssa viittaa likaantumiseen tai tukkeutumiseen [1].
Kun olet asettanut rampin, seuraava tehtävä on kohdistaa perfuusioreitti tukirakenteen geometriaan.
Valitse luminaalinen, ulkoinen tai monireittinen perfuusio tukirakenteen arkkitehtuurin mukaan
Sama periaate pätee perfuusioreitin valinnassa. Käytä luminaalista perfuusiota putkimaisille tukirakenteille, yhdistettyä sisäistä ja ulkoista virtausta levymäisille rakenteille ja monireittistä perfuusiota monimutkaisille 3D-tukirakenteille, joissa kuolleet alueet ovat todennäköisempiä.
Virtauksen tilajärjestelmän vertailutaulukko
| Virtauksen tilajärjestelmä | Käyttötarkoitus | Tyypilliset ohjausmuuttujat | Odotettu vaikutus solujen säilymiseen | Massansiirron suorituskyky | Pääasialliset vikaantumisriskit |
|---|---|---|---|---|---|
| Matala-leikkausvoimainen kylvöperfuusio | Alkuperäinen solujen kiinnittyminen ja tasainen jakautuminen | Matala virtausnopeus, minimaalinen leikkausjännitys | Korkea - mahdollistaa solujen ankkuroitumisen ennen leikkausvoiman kasvua | Rajoitettu; riippuu virtauksen läheisyydestä | Solujen laskeutuminen; epätasainen peitto; solujen menetys huonon kiinnittymisen vuoksi |
| Korkeamman virtauksen kulttuuriperfuusio | Pitkäaikainen kasvu ja korkean tiheyden ylläpito | Kasvava virtausnopeus, vakaa TMP, fluksi | Matalampi - painopiste siirtyy massansiirron tehokkuuteen | Korkea - vaaditaan keskusrunkoalueiden saavuttamiseksi | Kanavan tukkeutuminen; nekroottiset alueet; leikkausvoimien aiheuttamat soluvauriot |
Käsittele siirtymää kylvövirtauksesta viljelyvirtaukseen kirjattuna ramppina, ei yksinkertaisena kytkimenä.Se tekee prosessista helpommin toistettavan ja antaa selkeän perustan myöhempien ajokertojen hienosäätöön. Kun virtaus on vakautettu, valitse kylvömenetelmä, joka antaa parhaan peiton ja solujen pysyvyyden.
3. Käytä solujen kylvömenetelmiä, jotka parantavat peittoa ja pysyvyyttä
Käytä staattista viipymäkylvöä tai matalavirtaista perfuusiota alkuperäiseen kiinnittymiseen
Aloita staattisella viipymällä tai erittäin matalalla virtauksella varmistaaksesi alkuperäisen kiinnittymisen. Kiinnittymiseen riippuvaiset solut tarvitsevat viipymävaiheen ennen kuin siirryt perfuusioon. Jos siirrät ne suspensioon liian aikaisin, kasvu voi laskea. Ja jos kiinnittyminen on heikkoa, käytä miedointa mahdollista väliainetta, joka silti pitää solut elinkelpoisina viipymäjakson aikana.
Kun kiinnittyminen on varmistettu, valitse kylvöreitti, joka antaa parhaan peiton vähäisimmällä huuhtoutumisella.
Vertaa staattista dwell-seeding- ja matalavirtausperfusio-seeding-menetelmiä
Yhdistä menetelmä tukirakenteen avoimuuteen ja tarvitsemaasi solujen säilyttämistasoon. Staattinen dwell-seeding on yksinkertaisempi ja toimii hyvin soluille, jotka tarvitsevat aikaa pinnalla ennen virtauksen alkamista. Matalavirtausperfusio-seeding on parempi, kun tukirakenne tarvitsee aktiivista solujen liikettä rakenteen läpi passiivisen asettumisen sijaan.
Huokoisille tukirakenteille tavoitteena on siirtää solut tukirakenteeseen, ei jättää suurinta osaa niistä ulkopinnalle. Mutta tässä on haaste: jos siirryt perfuusioon liian aikaisin, huuhtoutuminen on todennäköisempää ennen kiinnittymisen vakiintumista [2] .
Valinnan tulisi perustua kolmeen asiaan:
- telineen avoimuus
- solujen tarttumisvoima
- kuinka tasaisesti solujen tulee levitä
Kylvömenetelmien vertailutaulukko
| Kylvömenetelmä | Paras käyttö | Pääasiallinen riski |
|---|---|---|
| Staattinen viipymäkylvö | Kiinnittymiseen riippuvaiset solut; telineet, joissa viipymäaika parantaa pysyvyyttä | Epäyhtenäinen jakautuminen tiheissä tai monimutkaisissa telinestruktuureissa |
| Matalavirtausperfuusio | Huokoiset telineet, jotka vaativat aktiivista solujen jakautumista rakenteen läpi | Huuhteleminen, jos virtausta ei nosteta varovasti ennen kiinnittymisen vakiintumista |
Seuraava askel on varmistaa peitto, pysyvyys ja varhainen huuhtoutuminen ennen virtauksen lisäämistä.
4. Seuraa prosessia ja ratkaise uudelleensolutuksen suorituskykyyn liittyviä ongelmia
Aseta anturit siten, että ne heijastavat todellisia tukirakenteen olosuhteita
Kun perfuusio on käynnissä, seuraa itse tukirakennetta, eikä pelkästään pääsilmukkaa. Käytännössä tämä tarkoittaa kammion sisääntulo- ja ulostulolukemien vertailua.
Sisääntulo-ulostulo DO -ero osoittaa hapen kulutuksen tukirakenteen sisällä. Käytä tätä eroa arvioidaksesi hapen kulutusta rakenteen sisällä ja sijoita näytteenottopisteet kammioon, jotta et päädy seuraamaan putkiston artefakteja. Lue TMP, virtaus ja DO yhdessä, ja linjaa ne samojen kirjattujen virtausvaiheiden kanssa, joita käytettiin kylvön ja viljelyvaiheiden aikana.
Optinen seuranta voi tulkita tukirakenteen olosuhteet väärin. Valon sironta ja taitekerroinero voivat vääristää signaalia, erityisesti paksummissa tai optisesti monimutkaisissa materiaaleissa. Vahvista optiset anturit tukimateriaalia vasten ennen kuin luotat niihin.
Jos nämä lukemat alkavat ajautua, käsittele kuvio prosessivirheenä, ei kertaluonteisena anturiongelmana.
Vianmääritys epätasaiselle jakautumiselle, nekroottisille alueille ja tukkeutuneille kanaville
Nämä signaalit auttavat erottamaan huonon kylvön ja rajoitetun perfuusion.
Epätasainen solujen jakautuminen tarkoittaa yleensä, että kylvöreitti ei vastannut tukirakenteen arkkitehtuuria tai virtaus nostettiin ennen kuin kiinnitys oli varma. Nekroottiset alueet viittaavat yleensä huonoon hapen saantiin. Tämä voi tapahtua, kun perfuusionopeus on liian alhainen, väliaineen vaihto on liian harvinaista tai tukkeutunut kanava katkaisee osan tukirakenteesta.
Jos virtaus laskee samalla kun TMP nousee, tarkista tukirakenne, putkisto ja portit likaantumisen tai tukkeutumisen varalta ennen kuin muutat virtausohjelmaa.
Estätyille kanaville suorita painehäviötarkistus telineen yli ennen prosessia ja sen aikana. Jos painehäviö kasvaa tasaisella virtausnopeudella, avoimuus heikkenee. Tämä on vahva varoitusmerkki ja siihen kannattaa reagoida ajoissa.
Alla oleva taulukko yhdistää yleiset vikatilat todennäköisiin syihin ja korjauksiin:
| Vikatila | Todennäköinen syy | Korjaus |
|---|---|---|
| Epäyhtenäinen solujakauma | Kylvöreitti ei vastaa tukirakennetta; virtaus aloitettu liian aikaisin | Tarkista kylvömenetelmä; pidennä viipymävaihetta ennen perfuusiota |
| Nekroottiset alueet | Riittämätön hapen saanti; tukkeutuneet kanavat | Lisää perfuusionopeutta vähitellen; tarkista tukirakenteen avoimuus |
| Nouseva TMP, laskeva virtaus | Tukirakenteen, putkiston tai portin likaantuminen tai tukkeutuminen | Tarkista tukirakenne ja portit; tarkista vaihtotiheys ja puhdistusjärjestys |
| pH:n ajautuminen | Jätteen kertyminen; riittämätön median vaihto | Lisää vaihtotiheyttä; varmista näytteenottoportin sijoittelu |
Päätelmä: Vakiinnuta toimivat käytännöt ja hienosäädä järjestelyä ajan myötä
Vakiinnuta tärkeät signaalit: sisääntulo–ulostulo happi, TMP, virtaus, pH ja näytetiedot. Sitten käytä kutakin ajokertaa hälytysten kynnysarvojen tiukentamiseen ja perfuusion rampien säätämiseen.
Joukkueille, jotka hankkivat kammioon yhteensopivia antureita ja perfuusio-laitteistoa,
Usein kysytyt kysymykset
Kuinka valitsen oikean bioreaktorin alustalleni?
Valitse bioreaktori, joka sopii alustatekniikkaasi ja viljelytavoitteisiisi. Järjestelmän on tuettava alustan fyysistä rakennetta, mukaan lukien sen huokoisuus ja mekaaninen lujuus, samalla kun se ylläpitää virtausolosuhteita, jotka sopivat solujen kiinnittymiseen ja ravinteiden kuljetukseen.
Kannattaa myös tarkastella, kuinka hyvin bioreaktori tukee kudoksen muodostumisen skaalausta ja vastaako se solujen kylvömenetelmääsi.
Milloin perfuusio tulisi aloittaa kylvämisen jälkeen?
Perfusio tulisi yleensä aloittaa, kun solut ovat kiinnittyneet ja alkaneet asettua alustalle. Jos virtaus alkaa liian aikaisin, se voi häiritä kylvämistä ja heikentää kiinnittymistä. Jos aloitat liian myöhään, riskinä on ravinteiden ehtyminen tai aineenvaihduntajätteiden kertyminen kudosrakenteeseen.
Käytännössä kytkentäkohta määräytyy usein a<|vq_11892|>aineenvaihdunnan aktiivisuuden ja hapenkulutuksen. perusteella. Nämä signaalit antavat selkeämmän kuvan siitä, milloin rakenne on valmis perfuusiolle ilman, että kulttuuriin lisätään vältettävissä olevaa stressiä.
Mitkä signaalit osoittavat parhaiten alustan perfuusio-ongelmat aikaisin?
Perfusio-ongelmien varhaiset merkit alusta-pohjaisessa viljellyn lihan tuotannossa ilmenevät yleensä aineenvaihduntatuotteissa ja ravinteiden otossa.
Perfusoiduissa järjestelmissä odottamaton glukoosin kulutus tai piikki laktaatin tuotannossa viittaa yleensä tukirakenteen arkkitehtuuriin, joka rajoittaa massakuljetusta.
