Kryopreservointi on prosessi, jossa elävät solut jäädytetään ja varastoidaan erittäin matalissa lämpötiloissa niiden elinkelpoisuuden säilyttämiseksi ajan myötä. Tämä menetelmä on kriittinen viljellyn lihan tuotannossa, varmistaen johdonmukaiset, vakaat solulinjat ja suojaten saastumiselta tai laitevikojen aiheuttamilta häviöiltä. Keskeiset vaiheet sisältävät:
- Valmistelu: Kerää soluja niiden kasvuvaiheessa, tarkista elinkelpoisuus (tavoitteena ≥90%), ja valmistele ne jäädytysnesteessä, jossa on kryosuoja-aineita kuten DMSO tai glyseroli.
- Jäädytys: Käytä hallittua jäähdytysnopeutta (-1°C - -3°C minuutissa) estääksesi jääkiteiden vaurioitumisen. Varastoi solut nestemäisessä typessä (-135°C - -190°C) pitkäaikaista säilytystä varten.
- Sulatus: Sulata solut nopeasti 37°C vesikylvyssä minimoidaksesi kryosuoja-aineen toksisuuden, siirrä sitten ne kasvunesteeseen toipumista varten.
- Laatuvalvonta: Merkitse ampullit tarkasti, seuraa säilytysolosuhteita ja testaa elinkelpoisuus sulatuksen jälkeen varmistaaksesi onnistuneen säilytyksen.
Täydellinen kryopreservointiprotokolla solulinjoille: 4-vaiheinen prosessi valmistelusta säilytykseen
Solujen valmistelu kryopreservointia varten
Solujen keruu ja elinkelpoisuuden tarkistukset
Parhaan palautumisen varmistamiseksi sulatuksen jälkeen, kerää soluja niiden logaritmisessa (log) kasvuvaiheessa. Adheenttisille solulinjoille tämä on tyypillisesti silloin, kun ne saavuttavat 80–90% konfluenssia [2][3][6].
Tarkista solujen elinkelpoisuus Trypan Blue -poissulkemismenetelmällä. Sekoita yhtä suuret osat (1:1) 0.4% Trypan Blue -väriainetta ja solususpensiota, ja laske sitten solut käyttämällä hemocytometriä.Elinkelpoiset solut sulkevat väriaineen pois ja näyttävät kirkkaalta mikroskoopin alla, kun taas elinkelpoiset solut värjäytyvät siniseksi [4]. Ihanteellisesti pyri vähintään 90% elinkelpoisuuteen parhaiden palautusprosenttien saavuttamiseksi, vaikka jotkut protokollat voivat hyväksyä vähimmäisen 75% [1][2][3][5].
Ennen sadonkorjuuta käytä mikroskooppia tarkistaaksesi bakteeri- tai homekontaminaation. Terveet suspensiosolut tulisi näkyä kirkkaina, pyöreinä ja taittavina käänteisessä faasikontrastimikroskoopissa [2][3].
Kun solut täyttävät vaaditut elinkelpoisuusstandardit, siirry esijäähdytysvaiheisiin.
Esijäähdytyksen valmistelut
Liitossoluille käytä hellävaraisia irrotusmenetelmiä, kuten trypsiiniä tai TrypLE Express, ja rajoita inkubointiaikaa solukalvojen vaurioitumisen välttämiseksi [5]. Valmistele solut konsentraatiossa 1 × 10⁶ - 1 × 10⁷ solua/mL, riippuen solulinjasta [1][6]. Aliquottaessa varmista, että solususpensio sekoitetaan usein, jotta se jakautuu tasaisesti cryovialien kesken [5].
Pidä jäädytysneste viileänä 2°C - 8°C välillä resuspensioiden aikana, jotta vähennetään cryoprotektantin toksisuutta ennen jäädytysprosessin aloittamista [5]. Kun solut on suspendoitu jäädytysnesteeseen, siirry nopeasti jäädytysprotokollaan [1].Säilytä solut aina mahdollisimman alhaisella passage-numerolla, jotta vähennetään geneettisen vaihtelun tai morfologisten muutosten riskiä [5][7].
Valitse cryoprotectantit ja jäädytysnesteet
Cryoprotectantti vaihtoehdot ja niiden toiminnot
Dimetyylisulfoksidi (DMSO) on laajasti käytetty cryoprotectantti, tyypillisesti 10% [2] pitoisuudessa. Se toimii tunkeutumalla solukalvoihin ja vähentämällä jään muodostumista jäädyttämisen aikana. Kuitenkin DMSO voi olla myrkyllistä soluille huoneenlämmössä, joten nopea sulatus on välttämätöntä altistuksen minimoimiseksi ja sen nopeaksi laimentamiseksi [1].
Glyseroli toimii hyödyllisenä vaihtoehtona DMSO:lle herkille solulinjoille, ja sitä käytetään yleensä pitoisuuksissa, jotka vaihtelevat 5% ja 15% [8].Se on erityisen tehokas solutyypeille, joissa DMSO saattaa aiheuttaa ei-toivottua erilaistumista [3], ja sillä on yleensä alhaisempi toksisuus verrattuna DMSO:hon.
Kohdentuotetussa lihassa perinteiset pakastusprotokollat käyttävät usein seosta 90% sikiönaudan seerumia (FBS) ja 10% DMSO [1]. Kuitenkin eläinperäisten komponenttien käyttö rajoittaa näitä menetelmiä skaalautuvuuden ja sääntelyhyväksynnän osalta [9]. Näiden ongelmien ratkaisemiseksi kemiallisesti määritellyt välineet - kuten Synth-a-Freeze tai Recovery Cell Culture Medium - tarjoavat vaihtoehdon ilman eläinperäisiä komponentteja. Nämä välineet ylläpitävät korkeaa solujen elinkykyä sulatuksen jälkeen samalla kun ne voittavat eläinperäisten komponenttien aiheuttamat haasteet [9].
Pakastusmateriaalien vertailu
Tässä on erittely eri pakastusmateriaalien eduista ja rajoituksista, joita käytetään viljellyn lihan tuotannossa:
| Materiaali | Edut | Haitat | Viljelty liha -soveltuvuus |
|---|---|---|---|
| 10% DMSO FBS-DMEM:ssä | Vakiintuneet protokollat [1] | Sisältää eläinperäisiä komponentteja; eräkohtainen vaihtelu [9] | Rajoitettu skaalautuvuus |
| Synth-a-Freeze | Kemiallisesti määritelty; johdonmukainen laatu; eläinperäisistä komponenteista vapaa [9] | Korkeampi alkuinvestointi [9] | Kyllä |
| Elvytys soluviljelymedia | Helppokäyttöinen; suunniteltu nopeaa palautumista varten [9] | Voi tarvita optimointia erityisille solulinjoille | Kyllä |
| 10% Glyseroli FBS:ssä | Vaihtoehto DMSO-herkille soluilla [1] | Perustuu eläinperäiseen seerumiin [9] | Rajoitettu skaalautuvuus |
Helmikuussa 2023 Tokion naisten lääketieteellisessä yliopistossa , Hironobu Takahashin johdolla, tutkijat osoittivat oikean pakastusmedian valinnan tärkeyden.Kaupallisten vaihtoehtojen, kuten CELLBANKER 1 ja 2, avulla he onnistuivat cryopreservoinnissa ensisijaisia naudan myogeenisiä soluja -80°C:ssa jopa vuoden ajan. Huomattavaa on, että nämä solut säilyttivät kykynsä lisääntyä ja erilaistua supistuvaksi lihaskudokseksi ehjillä sarkomeerirakenteilla sulatuksen jälkeen [10].
Kasvattamoliha tuotannossa kemiallisesti määritellyt ja GMP-yhteensopivat välineet ovat yhä suositumpia. Kuten STEMCELL Technologies korostaa:
Tiukasti säännellyillä aloilla, kuten solujen ja geeniterapiassa, suositellaan käytettäväksi GMP-valmistettuja, täysin määriteltyjä cryopreservointivälineitä varmistaakseen, että tuotteet valmistetaan ja valvotaan johdonmukaisesti laatuvaatimusten mukaisesti [9].
Alustat kuten
Kryokonservointimenettely ja jäähdytysnopeudet
Vaiheittainen pakastusprotokolla
Menestyksellisen kryokonservoinnin avain on ylläpitää tasaista jäähdytysnopeutta -1°C:sta -3°C:een minuutissa[2]. Tämä asteittainen prosessi mahdollistaa veden poistumisen soluista hitaasti, estäen vahingollisten solunsisäisten jääkristallien muodostumisen, jotka voisivat rikkoa solukalvoja[1].
Aloita sentrifugoimalla solut 150 x g:ssä 5 minuutin ajan[3]. Kun solut on sentrifugoitu, uudelleenripusta solupellet kylmässä pakastusmediassa, joka sisältää 10% DMSO konsentraatiossa 2–4×10⁶ solua/mL[3].DMSO-altistuksen vähentämiseksi siirry nopeasti seuraavaan vaiheeseen - pakastamiseen.
Jaa solususpensio esimerkkilaputettuihin kryogeenisiin putkiloihin. Jokaisessa putkilossa tulisi selkeästi ilmoittaa olennaiset tiedot, kuten solulinjan nimi, passausnumero, eränumero, solupitoisuus ja pakastuspäivämäärä[3]. Kun putkilot on valmisteltu, on aika valita ja käyttää sopivaa jäähdytyslaitteistoa.
Jäähdytyslaitteet ja tekniikat
Aseta putkilot välittömästi hallittuun jäähdytyslaiteeseen. Passiiviset pakastusastiat, kuten Nalgene "Mr Frosty" (joka käyttää isopropanolia) tai Corning "CoolCell", ovat suosittuja valintoja. Nämä työkalut voivat saavuttaa jäähdytysnopeuden noin 1°C minuutissa, kun ne asetetaan -80°C pakastimeen[2].
Suuremmille toiminnoille, joissa johdonmukaisuus on kriittistä, ohjelmoitava nopeudensäätöpakastin on paras vaihtoehto. Kuten Sigma-Aldrich toteaa:
ECACC käyttää säännöllisesti ohjelmoitavaa nopeudensäätöpakastinta. Tämä on luotettavin ja toistettavin tapa pakastaa soluja[3].
noin 24 tuntia -80°C:ssa, siirrä ampullit nestetyppikaasun vaiheeseen, jossa lämpötilat vaihtelevat -135°C:n ja -190°C:n välillä, pitkäaikaista säilytystä varten[4]. Vältä solujen säilyttämistä -80°C:ssa pidempään kuin viikko, sillä tämä voi heikentää niiden elinkelpoisuutta. Lämpötilat alle -135°C ovat välttämättömiä rajattomalle säilyttämiselle[2]. Kaasun vaiheen käyttö nestevaiheen sijaan vähentää ristiin saastumisen riskiä samalla kun lämpötilat pysyvät riittävän alhaisina.
Sulatus- ja palautusprosessit
Sulatusprosessi
Solujen nopea sulatus on ratkaisevan tärkeää rajoittaakseen myrkyllisten kryoprotektanttiyhteyksien altistumista ja estääkseen jääkristallien aiheuttaman vaurion. Varmista, että käytät koko kasvojen visiiriä ja eristettyjä käsineitä turvallisuuden vuoksi. Aloita poistamalla kryovialli nestetyppisäiliöstä ja löysäämällä korkkia hieman paineen vapauttamiseksi. Kiristä sitten korkki uudelleen.
Aseta vialli 37 °C vesikylpyyn, varmistaen, että korkki pysyy vedenpinnan yläpuolella. Anna sen sulaa 1–2 minuuttia tai kunnes vain muutama jääkristalli on jäljellä. Kun se on sulanut, pyyhi viallin ulkopinta 70% alkoholilla steriiliyden ylläpitämiseksi.
Siirrä viallin sisältö putkeen, joka sisältää 5–10 mL esilämmitettyä kasvualustaa. Lisää kasvualustaa hitaasti auttaaksesi vähentämään osmoottista shokkia. Jos työskentelet suspensiosolulinjojen kanssa, sentrifugoi solususpensio heti 300 × g 5 minuutin ajan 4 °C:ssa.Tämä vaihe auttaa pelletöimään solut ja poistamaan kryosuoja-aineen. Käänteiskeskityksen jälkeen, uudelleenripusta solut tuoreeseen välineeseen. Kiinnittyville soluille käänteiskeskitys on yleensä tarpeeton. Sen sijaan, siemen suoraan solut sopivaan viljelyastiaan ja poista kaikki jäljellä oleva DMSO ensimmäisen välineen vaihdon aikana, tyypillisesti 24 tunnin kuluttua.
Jälkeen sulatuksen arvioinnit
Heti sulatuksen jälkeen, tarkista solujen elinkyky varmistaaksesi, että palautuminen on onnistunut. Käytä Trypan Blue -poissulkemismenetelmää tätä arviointia varten. Ihanteellisesti solujen elinkyvyn tulisi ylittää 90% [11], mutta vähintään 75% on hyväksyttävää. 24 tunnin jälkeen, tarkista solut faasikontrastimikroskoopilla varmistaaksesi kiinnittymisen, arvioi solutiheys ja tarkista mahdolliset saastumisen merkit.
Jatka solujen seuraamista läpi siirtojen 1–3 varmistaaksesi normaalin lisääntymisen ja että ne säilyttävät odotetut ominaisuudet.Hitaasti toipuville solulinjoille voit parantaa eloonjäämistä lisäämällä alkuperäisen sikiönaudan seerumin pitoisuutta noin 20% v/v.
sbb-itb-ffee270
Säilytys ja pitkäaikainen elinkyky
Säilytysolosuhteet ja kesto
Solulinjojen elinkyvyn ylläpitämiseksi pitkällä aikavälillä on tärkeää säilyttää ne lämpötiloissa alle -135 °C [7][2]. Tämä varmistaa, että ne säilyvät ikuisesti.
Suositeltu menetelmä viljeltyjen lihasolulinjojen säilyttämiseen on höyryvaiheinen nestetyppi. Tämä tekniikka pitää lämpötilat välillä -135 °C ja -190 °C, mikä tekee siitä ihanteellisen pitkäaikaiseen säilyttämiseen ja tarjoaa parannettua turvallisuutta verrattuna nestefaasin säilytykseen.
Jos sinun tarvitsee säilyttää soluja -80 °C:ssa, rajoita tämä 24 tunnista viikkoon. Tämän jälkeen solujen elinkyky saattaa heikentyä.Tilapäistä säilytystä varten tässä lämpötilassa siirrä solut nestetyppisäilytykseen mahdollisimman pian.
Käytä standardeja steriilejä kryogeenisiä ampulleja (1–2 mL), joissa on sisäiset kierteet ja O-renkaat turvallista säilytystä varten [4][5]. Aina sijoita suljetut kryovialit kaasuvaiheeseen, ei nestemäiseen vaiheeseen typessä, vähentääksesi ampullien räjähdysriskiä sulatuksen aikana [5]. Lisäksi varmista, että suurikokoiset nestetyppisäiliöt pidetään vähintään puoliksi täynnä turvallisuusvaran ylläpitämiseksi.
Lopuksi, tiukat laatuvalvontatoimenpiteet ovat kriittisiä solujen pitkäaikaisen elinkelpoisuuden varmistamiseksi.
Laatuvalvontatarkastukset
Varmistaaksesi säilytettyjen solulinjojen luotettavuuden, noudata tiukkoja laatuvalvontaprotokollia. Aloita merkitsemällä jokainen ampulli tarkasti nestetyppikestäville etiketeille.Sisällytä olennaiset tiedot, kuten solulinjan tunnistus, eränumero, siirrosnumero ja pakastuspäivämäärä. Pidä sähköistä tietokantaa, johon rekisteröidään kunkin ampullin tarkka sijainti, mikä vähentää säilytysastioiden aukioloaikaa [7][2].
Ennen kuin sitoudut koko erien pitkäaikaiseen säilytykseen, testaa yhden ampullin elinkelpoisuus lyhytaikaisen kaasuvaiheen säilytyksen jälkeen. Tämä vaihe auttaa vahvistamaan, että pakastusprosessi oli onnistunut ja tunnistaa mahdolliset ongelmat [4][7][2]. Erittäin arvokkaille solustokille on viisasta säilyttää kopioita toissijaisessa sijainnissa suojautuaksesi laitevioilta tai paikallisilta katastrofeilta [7][2].
Varusta kaikki säilytysastiat lämpötilan valvontajärjestelmillä ja hälytyksillä, jotka havaitsevat alhaiset nestetyppitasot [7]. Asenna lisäksi happihälyttimiä säilytysalueille, jotka on asetettu aktivoitumaan 18% happipitoisuudessa (v/v), minimoidaksesi tukehtumisriskit nestetyppien kanssa työskenteleville henkilöille [7][2].
Eläinperäisten solulinjojen kryosäilytysvideoprotokolla
Yhteenveto ja keskeiset huomiot
Tässä on nopea yhteenveto olennaisista vaiheista ja suosituksista tehokkaaseen kryosäilytykseen viljellyn lihan tuotannossa:
- Solujen kerääminen: Kerää soluja niiden logaritmisessa kasvuvaiheessa, varmistaen, että elinkyky ylittää 90%.Käytä 10% DMSO:ta kryosuoja-aineena, vaikka glyseroli voi olla vaihtoehto herkimmille solulinjoille [11][1]
- Jäähdytys ja varastointi: Säilytä hallittu jäähdytysnopeus ja siirrä ampullit nopeasti höyryvaiheen nestetyppivarastoon solujen eheyden suojaamiseksi [11]
Roka Kakehin ym. tutkimus korostaa tarkkuuden merkitystä kryosäilytyksessä [10]:
"Luotettavan ja johdonmukaisen solulähteen varmistaminen kryosäilytyksen avulla mahdollistaa lupaavien solujen vakaamman tarjonnan viljellyn lihan tuotantoon." - Roka Kakehi ym., Tokion naisten lääketieteellinen yliopisto
- Sulatusprosessi: Sulata solut 37 °C vesikylvyssä noin kahden minuutin ajan, pysähtyen kun 80% jäästä on sulanut. Tämä vähentää DMSO:n toksisuutta ja parantaa solujen eloonjäämistä [1]. Seuraa sulatuksen jälkeisiä eloonjäämisen tarkistuksia varmistaaksesi onnistumisen ja hienosäätääksesi tulevia menettelyjä.
Nämä menetelmät toimivat käsi kädessä tiukkojen laatuvalvontakäytäntöjen kanssa. Merkitse aina ampullit tarkasti, pidä järjestelmällisiä asiakirjoja ja toteuta perusteelliset tarkastukset ennen pitkäaikaista varastointia [11]. Erityistarpeita varten, kuten kryosäilytyksessä, alustat kuten
UKK
Mitkä ovat kemiallisesti määriteltyjen medioiden etuja solulinjojen kryosäilytyksessä viljellyn lihan tuotannossa?
Kemiallisesti määritellyt mediat tuovat useita etuja solulinjojen kryosäilytyksessä viljellyn lihan tuotannossa.Poistamalla määrittelemättömät komponentit, kuten eläinperäiset seerumit, he varmistavat johdonmukaiset ja ennustettavat tulokset - mikä on ratkaiseva tekijä solulinjojen pitkäaikaisen luotettavuuden ylläpitämisessä.
Toinen keskeinen etu on vähentynyt kontaminaatioriski ja vaihtelu. Tämä ei ainoastaan tue korkeampia laatu- ja turvallisuusstandardeja, vaan myös vastaa täydellisesti tarkkuuden ja skaalautuvuuden vaatimuksia, jotka ovat tarpeen sekä sääntelyvaatimusten että kuluttajien odotusten täyttämiseksi viljellyn lihan teollisuudessa.
Miten cryoprotectantin valinta vaikuttaa solujen eloonjäämiseen jäädyttämisen ja sulattamisen aikana?
Cryoprotectantin valinta on keskeinen tekijä solujen terveyden säilyttämisessä jäädyttämisen ja sulattamisen aikana. Kaksi laajasti käytettyä vaihtoehtoa ovat dimetyylisulfoksidi (DMSO) ja glyseroli, joilla on kummallakin omat erityispiirteensä. DMSO tunnetaan kyvystään tunkeutua soluihin nopeasti ja tarjota vahvaa suojaa.Kuitenkin siihen liittyy varoitus: korkeissa pitoisuuksissa tai pitkän altistuksen aikana se voi muuttua myrkylliseksi, mikä voi mahdollisesti laskea solujen elinkelpoisuutta.
Glyseroli sen sijaan on vähemmän myrkyllinen ja sitä voidaan käyttää suoraan. Sen haittapuoli on sen hitaampi solujen läpäisynopeus, mikä voi johtaa vähemmän välittömään suojaan verrattuna DMSO:hon.
Oikean tasapainon saavuttaminen on ratkaisevan tärkeää. Kryoprotektantin pitoisuuden ja altistusaikojen asianmukainen säätäminen auttaa suojaamaan soluja samalla kun minimoidaan myrkyllisyyden riski. Lisäksi parhaita käytäntöjä noudattaminen jäähdytysnopeuksien ja varastointolosuhteiden osalta on olennaista, jotta varmistetaan mahdollisimman korkeat elvytysasteet sulatuksen jälkeen.
Miksi jäähdytysnopeuden hallinta on tärkeää kryosäilytyksessä?
Vakaan jäähdytysnopeuden ylläpitäminen, yleensä välillä –1°C ja –3°C minuutissa, on avainasemassa solujen elinkelpoisuuden säilyttämisessä.Jäähdytys vähitellen mahdollistaa solujen kuivumisen hallitussa tahdissa, mikä vähentää haitallisten jääkristallien muodostumisen mahdollisuutta, jotka voivat repiä tai vahingoittaa solukalvoja.
Tämä mitattu lähestymistapa suojaa solujen rakennetta, parantaen niiden selviytymistä ja toimivuutta sulatuksen jälkeen. Tarkkojen jäähdytysprotokollien noudattaminen on olennaista solulinjojen onnistuneen pitkäaikaissäilytyksen ja palauttamisen varmistamiseksi.
