Criopreservación es el proceso de congelar y almacenar células vivas a temperaturas ultra bajas para mantener su viabilidad a lo largo del tiempo. Este método es crítico para la producción de carne cultivada, asegurando líneas celulares consistentes y estables y protegiendo contra pérdidas por contaminación o fallos de equipo. Los pasos clave incluyen:
- Preparación: Cosechar células durante su fase de crecimiento, verificar la viabilidad (apuntar a ≥90%) y prepararlas en medios de congelación con crioprotectores como DMSO o glicerol.
- Congelación: Usar una tasa de enfriamiento controlada (-1°C a -3°C por minuto) para prevenir el daño por cristales de hielo. Almacenar las células en vapor de nitrógeno líquido (-135°C a -190°C) para preservación a largo plazo.
- Descongelación: Descongelar rápidamente las células en un baño de agua a 37°C para minimizar la toxicidad del crioprotector, luego transferirlas a medios de crecimiento para su recuperación.
- Control de Calidad: Etiquete los viales con precisión, monitoree las condiciones de almacenamiento y pruebe la viabilidad después de la descongelación para asegurar una preservación exitosa.
Protocolo Completo de Criopreservación para Líneas Celulares: Proceso de 4 Pasos desde la Preparación hasta el Almacenamiento
Preparación de Células para Criopreservación
Cosecha de Células y Verificación de Viabilidad
Para asegurar la mejor recuperación después de la descongelación, coseche las células durante su fase de crecimiento logarítmico (log). Para las líneas celulares adherentes, esto es típicamente cuando alcanzan el 80–90% de confluencia [2][3][6].
Verifique la viabilidad de las células utilizando el método de exclusión de Azul de Tripano. Mezcle partes iguales (1:1) de Azul de Tripano al 0.4% con la suspensión celular, luego cuente las células usando un hemocitómetro.Las células viables excluirán el tinte y aparecerán brillantes bajo el microscopio, mientras que las células no viables se teñirán de azul [4]. Idealmente, apunte a una viabilidad de al menos 90% para obtener las mejores tasas de recuperación, aunque algunos protocolos pueden aceptar un mínimo de 75% [1][2][3][5].
Antes de la cosecha, use un microscopio para verificar la contaminación bacteriana o fúngica. Las células en suspensión saludables deben aparecer brillantes, redondas y refráctiles bajo un microscopio de contraste de fase invertida [2][3].
Una vez que las células cumplan con los estándares de viabilidad requeridos, pase a los pasos previos a la congelación.
Preparaciones Previas a la Congelación
Para células adherentes, use métodos de disociación suaves, como tripsina o TrypLE Express, y limite el tiempo de incubación para evitar dañar las membranas celulares [5]. Prepare las células a una concentración de 1 × 10⁶ a 1 × 10⁷ células/mL, dependiendo de la línea celular [1][6]. Mientras alícuota, asegúrese de que la suspensión celular se mezcle con frecuencia para mantener una distribución uniforme en los crioviales [5].
Mantenga el medio de congelación enfriado entre 2°C y 8°C durante la resuspensión para reducir la toxicidad del crioprotector antes de que comience el proceso de congelación [5]. Una vez que las células estén suspendidas en el medio de congelación, proceda rápidamente al protocolo de congelación [1].Siempre criopreserve las células en el menor número de pasajes posible para reducir el riesgo de deriva genética o cambios morfológicos [5][7].
Selección de Crioprotectores y Medios de Congelación
Opciones de Crioprotectores y Sus Funciones
Dimetilsulfóxido (DMSO) se utiliza ampliamente como crioprotector, típicamente a una concentración del 10% [2]. Funciona penetrando las membranas celulares y reduciendo la formación de hielo durante la congelación. Sin embargo, el DMSO puede ser tóxico para las células a temperatura ambiente, por lo que es esencial descongelar rápidamente para minimizar la exposición y diluirlo rápidamente [1].
Glicerol sirve como una alternativa útil para líneas celulares sensibles al DMSO, generalmente utilizado en concentraciones que van del 5% al 15% [8].Es particularmente efectivo para tipos de células donde el DMSO podría causar una diferenciación no deseada [3], y tiende a tener una toxicidad más baja en comparación con el DMSO.
En aplicaciones de carne cultivada, los protocolos de congelación tradicionales a menudo utilizan una mezcla de 90% de Suero Fetal Bovino (FBS) y 10% de DMSO [1]. Sin embargo, la dependencia de componentes derivados de animales limita estos métodos en términos de escalabilidad y aprobación regulatoria [9]. Para abordar estos problemas, medios químicamente definidos - como Synth-a-Freeze o Recovery Cell Culture Medium - proporcionan una alternativa libre de componentes animales. Estos medios mantienen una alta viabilidad celular post-descongelación mientras superan los desafíos asociados con componentes de origen animal [9].
htmlComparación de Medios de Congelación
A continuación, se presenta un desglose de las ventajas y limitaciones de varios medios de congelación utilizados en la producción de carne cultivada:
| Medio | Ventajas | Desventajas | Adecuación para Carne Cultivada |
|---|---|---|---|
| 10% DMSO en FBS-DMEM | Protocolos establecidos [1] | Contiene componentes derivados de animales; variabilidad de lote [9] | Escalabilidad limitada |
| Synth-a-Freeze | Definido químicamente; calidad consistente; libre de componentes animales [9] | Costo inicial más alto [9] | Sí |
| Medio de Cultivo Celular de Recuperación | Fácil de usar; diseñado para una recuperación rápida [9] | Puede necesitar optimización para líneas celulares específicas | Sí |
| 10% Glicerol en FBS | Alternativa para células sensibles al DMSO [1] | Depende de suero de origen animal [9] | Escalabilidad limitada |
En febrero de 2023, investigadores de Tokyo Women's Medical University, liderados por Hironobu Takahashi, demostraron la importancia de elegir el medio de congelación adecuado. Usando opciones comerciales como CELLBANKER 1 y 2, criopreservaron con éxito células miogénicas bovinas primarias a –80°C durante hasta un año. Notablemente, estas células conservaron su capacidad para proliferar y diferenciarse en tejido muscular contráctil con estructuras de sarcómero intactas después de la descongelación [10].
Para la producción de carne cultivada, los medios químicamente definidos y compatibles con GMP son cada vez más preferidos. Como STEMCELL Technologies destaca:
En campos altamente regulados como la terapia celular y génica, se recomienda usar un medio de criopreservación fabricado bajo GMP y completamente definido para asegurar que los productos se produzcan y controlen consistentemente de acuerdo con los estándares de calidad [9].
Plataformas como
Procedimiento de Criopreservación y Tasas de Enfriamiento
Protocolo de Congelación Paso a Paso
La clave para una criopreservación exitosa radica en mantener una tasa de enfriamiento constante de -1°C a -3°C por minuto[2]. Este proceso gradual permite que el agua salga de las células lentamente, evitando la formación de cristales de hielo intracelulares dañinos que podrían romper las membranas celulares[1].
Comience centrifugando las células a 150 x g durante 5 minutos[3]. Una vez centrifugadas, resuspenda el pellet celular en un medio de congelación frío que contenga 10% DMSO a una concentración de 2–4×10⁶ células/mL [3].Para reducir la exposición al DMSO, pase rápidamente al siguiente paso: congelación.
Distribuya la suspensión celular en viales criogénicos previamente etiquetados. Cada vial debe indicar claramente detalles esenciales como el nombre de la línea celular, el número de pasaje, el número de lote, la concentración celular y la fecha de congelación[3]. Con los viales preparados, es hora de seleccionar y utilizar el equipo de enfriamiento adecuado.
Equipo y Técnicas de Enfriamiento
Coloque los viales inmediatamente en un dispositivo de enfriamiento de tasa controlada. Los contenedores de congelación pasiva, como el Nalgene "Mr Frosty" (que utiliza isopropanol) o el Corning "CoolCell" , son opciones populares. Estas herramientas pueden lograr una tasa de enfriamiento de aproximadamente 1°C por minuto cuando se colocan en un congelador a -80°C[2] .
Para operaciones a gran escala donde la consistencia es crítica, un congelador programable con control de velocidad es la mejor opción. Como afirma Sigma-Aldrich:
ECACC utiliza rutinariamente un congelador programable con control de velocidad. Esta es la forma más confiable y reproducible de congelar células[3] .
Después de aproximadamente 24 horas a -80°C, transfiera los viales a la fase de vapor de nitrógeno líquido, donde las temperaturas oscilan entre -135°C y -190°C, para almacenamiento a largo plazo [4]. Evite almacenar células a -80°C por más de una semana, ya que esto puede comprometer su viabilidad. Las temperaturas por debajo de -135°C son esenciales para la preservación indefinida[2]. Usar la fase de vapor en lugar de la fase líquida reduce el riesgo de contaminación cruzada mientras se mantienen temperaturas suficientemente bajas.
Protocolos de Descongelación y Recuperación
Proceso de Descongelación
Descongelar las células rápidamente es crucial para limitar la exposición tóxica al crioprotector y prevenir que los cristales de hielo causen daño. Asegúrese de usar un visor de cara completa y guantes aislantes para seguridad. Comience retirando el criovial del nitrógeno líquido y aflojando ligeramente la tapa para liberar cualquier presión acumulada. Luego, vuelva a apretar la tapa.
Coloque el vial en un baño de agua a 37°C, asegurándose de que la tapa permanezca por encima de la línea de agua. Déjelo descongelar durante 1–2 minutos, o hasta que solo queden unos pocos cristales de hielo. Una vez descongelado, limpie el exterior del vial con alcohol al 70% para mantener la esterilidad.
Transfiera el contenido del vial a un tubo que contenga 5–10 mL de medio de cultivo precalentado. Agregue el medio lentamente para ayudar a reducir el choque osmótico. Si está trabajando con líneas celulares en suspensión, centrifugue la suspensión celular inmediatamente a 300 × g durante 5 minutos a 4°C.Este paso ayuda a peletizar las células y elimina el crioprotector. Después de la centrifugación, resuspenda las células en un medio fresco. Para las células adherentes, la centrifugación generalmente no es necesaria. En su lugar, siembre directamente las células en un recipiente de cultivo adecuado y elimine cualquier DMSO residual durante el primer cambio de medio, típicamente después de 24 horas.
Evaluaciones Post-Descongelación
Justo después de la descongelación, verifique la viabilidad celular para asegurar que la recuperación haya sido exitosa. Use el método de exclusión de Azul de Tripano para esta evaluación. Idealmente, la viabilidad celular debería exceder el 90% [11], pero un mínimo del 75% es aceptable. Después de 24 horas, inspeccione las células bajo un microscopio de contraste de fases para confirmar la adherencia, evaluar la densidad celular y verificar cualquier signo de contaminación.
Continúe monitoreando las células a través de los pasajes 1–3 para asegurar una proliferación normal y que retengan sus características esperadas.Para las líneas celulares que se recuperan más lentamente, puede mejorar la supervivencia aumentando la concentración inicial de suero fetal bovino a alrededor del 20% v/v.
sbb-itb-ffee270
Almacenamiento y Viabilidad a Largo Plazo
Condiciones y Duración de Almacenamiento
Para mantener la viabilidad de las líneas celulares a largo plazo, es esencial almacenarlas a temperaturas por debajo de -135°C [7][2]. Esto asegura que permanezcan preservadas indefinidamente.
El método preferido para almacenar líneas celulares de carne cultivada es el nitrógeno líquido en fase vapor. Esta técnica mantiene temperaturas entre -135°C y -190°C, lo que la hace ideal para la preservación a largo plazo, ofreciendo mayor seguridad en comparación con el almacenamiento en fase líquida.
Si necesita almacenar células a -80°C, limite esto a un período de 24 horas a una semana. Más allá de este tiempo, la viabilidad celular puede disminuir.Para el almacenamiento temporal a esta temperatura, transfiera las células al almacenamiento en nitrógeno líquido lo antes posible.
Utilice viales criogénicos estériles estándar (1–2 mL) con rosca interna y una junta tórica para un almacenamiento seguro [4][5]. Siempre coloque los crioviales sellados en la fase gaseosa en lugar de la fase líquida del nitrógeno para reducir el riesgo de explosiones de viales durante la descongelación [5]. Además, asegúrese de que los recipientes de nitrógeno líquido a granel se mantengan al menos a la mitad de su capacidad para mantener un margen de seguridad.
Finalmente, las medidas rigurosas de control de calidad son críticas para asegurar la viabilidad a largo plazo de las células.
Controles de Calidad
Para asegurar la fiabilidad de las líneas celulares almacenadas, siga protocolos estrictos de control de calidad. Comience etiquetando con precisión cada vial con etiquetas resistentes al nitrógeno líquido.Incluya detalles esenciales como la identidad de la línea celular, número de lote, número de pasaje y fecha de congelación. Mantenga una base de datos electrónica para registrar la ubicación exacta de cada vial, lo que reduce el tiempo que los recipientes de almacenamiento necesitan permanecer abiertos [7][2].
Antes de comprometer lotes enteros al almacenamiento a largo plazo, pruebe la viabilidad de un vial después del almacenamiento a corto plazo en fase gaseosa. Este paso ayuda a confirmar que el proceso de congelación fue exitoso e identifica cualquier problema potencial [4][7][2]. Para existencias de células de alto valor, es prudente almacenar duplicados en una ubicación secundaria para protegerse contra fallos de equipo o desastres locales [7][2].
Equipa todos los recipientes de almacenamiento con sistemas de monitoreo de temperatura y alarmas para detectar niveles bajos de nitrógeno líquido [7]. Además, instala alarmas de oxígeno en las áreas de almacenamiento, configuradas para activarse al 18% de oxígeno (v/v), para minimizar los riesgos de asfixia para el personal que trabaja con nitrógeno líquido [7][2].
Protocolo en video para la criopreservación de líneas celulares de mamíferos
Conclusión y Puntos Clave
Aquí tienes un resumen rápido de los pasos esenciales y recomendaciones para una criopreservación efectiva en la producción de carne cultivada:
- Cosecha de Células: Recoge las células durante su fase de crecimiento logarítmico, asegurando que la viabilidad supere el 90%. Usa 10% de DMSO como crioprotector, aunque el glicerol puede ser una alternativa para líneas celulares más delicadas [11][1].
- Enfriamiento y Almacenamiento: Mantener una tasa de enfriamiento controlada y transferir rápidamente los viales al almacenamiento en nitrógeno líquido en fase vapor para salvaguardar la integridad celular [11]
Un estudio de Roka Kakehi et al. destaca la importancia de la precisión en la criopreservación [10]:
"Asegurar una fuente confiable y consistente de células mediante el uso de criopreservación nos permitirá aumentar el suministro estable de células prometedoras para la producción de carne cultivada." - Roka Kakehi et al., Universidad Médica de Mujeres de Tokio
- Proceso de Descongelación: Descongelar las células en un baño de agua a 37°C durante unos dos minutos, deteniéndose cuando el 80% del hielo se haya derretido. Esto reduce la toxicidad del DMSO y mejora la recuperación celular [1]. Realizar controles de viabilidad post-descongelación para asegurar el éxito y ajustar procedimientos futuros.
Estos métodos funcionan de la mano con prácticas estrictas de control de calidad. Siempre etiquete los viales con precisión, mantenga registros organizados e implemente verificaciones exhaustivas antes del almacenamiento a largo plazo [11]. Para necesidades especializadas de criopreservación, plataformas como
Preguntas Frecuentes
¿Cuáles son las ventajas de usar medios químicamente definidos para criopreservar líneas celulares en la producción de carne cultivada?
Los medios químicamente definidos ofrecen múltiples beneficios cuando se trata de criopreservar líneas celulares para la producción de carne cultivada. Al eliminar componentes indefinidos, como el suero derivado de animales, aseguran resultados consistentes y predecibles, un factor crucial para mantener la fiabilidad a largo plazo de las líneas celulares.
Otra ventaja clave es el riesgo reducido de contaminación y variabilidad. Esto no solo respalda estándares más altos de calidad y seguridad, sino que también se alinea perfectamente con la precisión y escalabilidad requeridas para cumplir tanto con las demandas regulatorias como con las expectativas de los consumidores en la industria de la carne cultivada.
¿Cómo influye la elección del crioprotector en la supervivencia celular durante la congelación y descongelación?
La elección del crioprotector es un factor clave en la preservación de la salud celular durante la congelación y descongelación. Dos opciones ampliamente utilizadas son dimetilsulfóxido (DMSO) y glicerol, cada uno con características distintas. Se sabe que el DMSO tiene la capacidad de penetrar rápidamente en las células y proporcionar una fuerte protección. Sin embargo, viene con una advertencia: a altas concentraciones o con exposición prolongada, puede volverse tóxico, potencialmente reduciendo la viabilidad celular.
El glicerol, en contraste, es menos tóxico y se puede aplicar directamente.Su desventaja radica en su tasa más lenta de penetración celular, lo que puede resultar en una protección menos inmediata en comparación con el DMSO.
Lograr el equilibrio adecuado es crucial. Ajustar correctamente la concentración y el tiempo de exposición del crioprotector ayuda a proteger las células mientras se minimiza el riesgo de toxicidad. Además, adherirse a las mejores prácticas para las tasas de enfriamiento y las condiciones de almacenamiento es esencial para asegurar las tasas de recuperación más altas posibles después de la descongelación.
¿Por qué es importante controlar la tasa de enfriamiento durante la criopreservación?
Mantener una tasa de enfriamiento constante, generalmente entre –1°C y –3°C por minuto, es clave para mantener las células viables. Enfriar gradualmente permite que las células se deshidraten a un ritmo controlado, reduciendo la posibilidad de que se formen cristales de hielo dañinos, que pueden rasgar o dañar las membranas celulares.
Este enfoque medido protege la estructura de las células, mejorando su supervivencia y funcionalidad una vez descongeladas.Seguir protocolos de enfriamiento precisos es esencial para asegurar el almacenamiento a largo plazo y la recuperación exitosa de líneas celulares.
