Jos käytät viljeltyä lihamediaa suuressa mittakaavassa, suora uudelleenkäyttö ei ole ratkaisu. Käsittelisin kierrätystä suljetun kierron konditionointivaiheena: mittaa ensin käytetty media, poista estäjät, kuten ammoniakki ja laktaatti, palauta proteiinit vain silloin, kun se on kannattavaa, sitten kunnosta ja tarkista erä solujen suorituskyvyn ja steriiliyden suhteen ennen uudelleenkäyttöä.
Yksinkertaisesti sanottuna, tämä artikkeli osoittaa, että median kierrätys ei ole “käytetty sisään, käytetty ulos”.Se on prosessipäätös, joka perustuu kolmeen kysymykseen:
- Mitä on jäljellä, jota voin käyttää uudelleen?
- Mikä nyt estää solujen kasvua tai siirtää prosessinhallintaa?
- Mitä minun on palautettava ennen kuin väliaine palaa viljelyyn?
Jos perustaisin kierrätyssilmukan, aloittaisin näillä tarkistuksilla heti:
- Kemia: glukoosi, aminohapot, laktaatti, ammoniakki, pH, osmolaliteetti, suolat, rauta
- Proteiinin talteenottotavoitteet: albumiini ja transferriini
- Turvallisuus: jätteet, mikrobit, endotoksiinit, sekä toksisuus- ja allergeenitarkastukset
- Toiminto: elinkelpoisuus, kaksinkertaistumisaika yli 4 passagen triplikaatissa , fenotyyppimarkkerit ja erilaistumislukemat verrattuna tuoreväliainekontrolleihin
Artikkeli myös rajaa prosessivalintoja. Ammoniakaalinen alkalointi sopii tapauksiin, joissa ammoniakki on pääasiallinen ongelma, mutta korkea pH voi vahingoittaa proteiinien aktiivisuutta, joten väliaine tarvitsee usein lisäkäsittelyä ennen uudelleenkäyttöä. Se selittää myös, missä kierrätyssilmukat sijaitsevat erä-, syöttöerä- ja perfuusio -asetuksissa, ja milloin lisäkäsittely, odotusaikariskit ja kontaminaation hallinta voivat tehdä kierrätyksestä väärän valinnan.
Bioprosessien insinööreille ja soluviljelytiimeille ydinviesti on yksinkertainen: valitse kevyin toimenpide, joka poistaa mitatun pullonkaulan, sopii prosessitilaasi ja täyttää vapautuskriteerit laajassa mittakaavassa.
Viljellyn lihan väliaineen kierrätys: vaiheittainen päätöksentekokehys
Kuinka karakterisoida käytetty väliaine ennen kierrätystä
Käytetty väliaine ei pysy kemiallisesti staattisena viljelyn aikana.Solut kuluttavat ravinteita, vapauttavat metaboliitteja, muuttavat pH-arvoa ja muuttavat väliaineen proteiiniprofiilia. Tämä tarkoittaa, että mittaus tulee ensin. Ennen kuin suunnittelet kierrätyssilmukan, tarvitset selkeän kuvan siitä, mikä on edelleen käyttökelpoista, mikä on nyt estävää ja mikä on muuttunut turvallisuusriskiksi.
Tämä karakterisointivaihe auttaa määrittämään, onko oikea reitti yksinkertainen sekoitus, valikoiva talteenotto vai täydellinen regenerointi.
Keskeiset estävät ja talteenotettavat komponentit mitattavaksi
Aloita mittaamalla kaksi komponenttiryhmää: poistettavat estäjät ja talteenoton arvoiset komponentit .
Poistopuolella mitataan:
- laktaatti
- ammoniakki
- jäännössokeri
- aminohapot
- rauta
- pH
- osmolaliteetti
- suolat
Palautuspuolella albumiini ja transferriini ovat pääkohteet. Transferriini ansaitsee erityistä huomiota, koska suurimolekyylipainoiset proteiinit, kuten transferriini, ovat alttiita eräkohtaisille laatuvaihteluille.
Sinun tulisi myös mitata kasvutekijät, jäänteet, mikrobit ja endotoksiinit ennen kierrätyspäätöksen tekemistä. Solujäänteet voivat häiritä jatkoprosessointia ja vähentää kokonaismäärää. Mikrobi- ja endotoksiinitestaus on myös tarpeen elintarviketurvallisuuden näkökulmasta. Turvallisuuden karakterisoinnin tulisi kattaa myös toksisuus ja allergeenisuus uusien elintarviketurvallisuusvaatimusten täyttämiseksi [3] [2].
Koostumustiedot kertovat sinulle mitä muuttui. Toiminnallinen testaus kertoo, toimiiko kierrätetty väliaine edelleen viljelyssä.
Kierrätetyn väliaineen suorituskykykriteerit
Pelkästään koostumustiedot eivät riitä kierrätetyn väliaineen hyväksymiseen uudelleenkäyttöön. Kierrätetty osuus on tarkistettava toiminnallisten suorituskykykriteerien perusteella ennen kuin se palautetaan prosessiin.
Solujen elinkyky ja kaksinkertaistumisaika ovat lähtökohta. Seuraa kaksinkertaistumisaikaa neljän passagen ajan kolminkertaisena. Tämä auttaa havaitsemaan piileviä estäviä vaikutuksia, jotka yhden passagen testi voi jättää huomaamatta [1] . Jos käytät suspensioviljelmää, varmista, että kierrätetty väliaine tukee edelleen suspensiokasvua, koska tämä muutos voi hidastaa lisääntymistä, kun koostumusta ei ole säädetty oikein [1].
Jos prosessisi riippuu erilaistumisesta, erilaistumissuorituskyky on mitattava suoraan. Esimerkiksi adipogeeninen potentiaali voidaan kvantifioida lipidikertymämarkkereilla, kuten BODIPY yhdessä tumavärjäyksen kanssa käyttäen DAPI [1] . Fenotyyppinen stabiilisuus on myös syytä tarkistaa virtaussytometrialla, käyttäen pintamarkkereita kuten CD29, CD56 ja CD90 varmistaaksesi, että kierrätetyssä mediassa ylläpidetyt solut säilyttävät edelleen tarkoitetun mesenkymaalisen tai myoblastiprofiilin [1] .
Jos kierrätetty fraktio sisältää suurimolekyylipainoisia proteiineja, joilla on vaihteleva aktiivisuus, prosessin johdonmukaisuuden ylläpitäminen tulee vaikeammaksi. Kemiallisesti stabiilit komponentit ovat yleensä turvallisempi valinta, jos mahdollista.
Käytä kemiallista testausta ja toiminnallista testausta yhdessä, kun kierrätetyn median kelpoisuutta arvioidaan uudelleenkäyttöä varten.
| Suorituskyvyn kriteeri | Varmennusmenetelmä | Tavoitetulos |
|---|---|---|
| Solujen lisääntyminen | Kaksinkertaistumisajan arviointi (kolminkertaiset pullot, 4+ passaasia) | Jatkuvat tai parantuneet kasvunopeudet |
| Fenotyyppinen stabiilisuus | Virtaussytometria (CD29, CD56, CD90) | Mesenkymaalisten tai myoblastimerkkien säilyminen |
| Differentoituminen | BODIPY/DAPI lipidivärjäys | Onnistunut kypsyminen lihas- tai rasvasoluiksi |
| Väliaineen johdonmukaisuus | Kemiallinen stabiilisuusanalyysi | Ravinteiden/kasvutekijöiden pitoisuuden vähäinen vaihtelu |
| Steriiliys | Monivaiheinen mikrobien ja endotoksiinien testaus | Ei elinkelpoisia epäpuhtauksia; endotoksiini spesifikaation mukainen |
Vasta sen jälkeen voit valita kierrätysmenetelmän, joka aiheuttaa vähiten häiriöitä.
sbb-itb-ffee270
Viljellyn lihan media-kierrätystekniikat
Valitsemasi kierrätysmenetelmä riippuu siitä, mikä komponentti täytyy poistaa ja miten muu prosessi on järjestetty.
Alkalointi ja ammoniakin poisto
Kun ammoniakki on pääasiallinen estävä tekijä, alkalointi ja poisto tarjoavat suoran poistovaiheen. Tämä reitti on järkevä, kun käytetyn median analyysi osoittaa ammoniakin olevan hallitseva estäjä.
Alkalointi nostaa pH-arvoa, mikä muuttaa ammoniumin (NH₄⁺) ammoniakiksi (NH₃). Tämä ammoniakki poistetaan sitten mediasta. Se on yksinkertainen idea, mutta siinä on kompromissi: korkea pH voi denaturoida herkkiä kasvutekijöitä ja proteiineja. Siksi käytännössä perusmedia täytyy yleensä kunnostaa ennen uudelleenkäyttöä.
Tämä tekee menetelmästä hyödyllisen ammoniakin hallintaan, mutta vähemmän sopivan, kun proteiinien säilyttäminen on tärkeää.
Prosessisuunnittelu, ympäristövaikutukset ja toteutus
Kun talteenottomenetelmä on määritetty, seuraava tehtävä on sijoittaa se viljelykiertoon rikkomatta steriiliyttä tai prosessin johdonmukaisuutta.
Kierrätyssilmukoiden sovittaminen erä-, syöttöerä- ja perfuusiojärjestelmiin
Sovita kierrätys kohtaan, jossa väliaine poistuu ja palaa prosessiin. Eräprosessissa se tarkoittaa sadonkorjuun jälkeen. Syöttöerässä se sijaitsee syöttöjen välillä. Perfusiossa se toimii kontrolloituna sivuvirtana. Tämä asetus pitää kierrätysvaiheen sidottuna siihen, miten kukin tila jo vaihtaa väliaineita, sen sijaan että se muuttuisi erilliseksi käsittelyvaiheeksi.
Seuraa keskeisiä prosessimerkkejä, kuten laktaatti, ammoniakki, glukoosi, osmolaliteetti ja proteiinipitoisuus käyttämällä online- tai offline-mittauksia. Aseta selkeät steriiliyskontrollit sekä maksimiaikojen rajat ennen kuin kierrätetty väliaine palaa viljelyyn.
Kun väliaineen kierrätys ei ehkä ole oikea valinta
Kierrätys on järkevää vain silloin, kun osittainen uudelleenkäyttö ja valikoiva metaboliittien poisto vähentävät jätettä merkityksellisellä tavalla, ja kun prosessi kestää ylimääräisen käsittelyn sekä kontaminaatiokontrollit.
Jätä kierrätys väliin, kun lisätty prosessin monimutkaisuus, jätteenkäsittelytaakka tai kontaminaatioriski on suurempi kuin saavutettu hyöty.
Laitteiden hankinta ja validointityönkulut
Kierrätyssilmukan käyttöönotto vaatii oikeat prosessilaitteet, anturit ja analyysityökalut, sekä kiinteän validointityönkulun jokaiselle kierrätetylle erälle.Joukkueille, jotka hankkivat tätä kokoonpanoa,
Määritä valvonta- ja steriiliyskontrollit ennen vapautusta, jotta jokainen kierrätetty erä tarkistetaan samojen kriteerien mukaan. Tämä validointivaihe tekee kierrätyssilmukasta toistettavan tuotantomittakaavassa.
Päätelmä: Oikean kierrätysstrategian valitseminen viljellylle lihalle
Aloita käytetyn median karakterisoinnilla. Valitse sitten vähiten häiritsevä toimenpide, jota tiedot voivat tukea.
Kun tiedät, missä pullonkaulat ovat, päätä, onko palautus vai korvaaminen järkevämpää. Useimmissa tapauksissa ammoniakki ja laktaatti ovat ensimmäisiä kohteita.Sen jälkeen seuraava päätös on, palautetaanko vai korvataanko arvokkaat proteiinit, kuten transferriini ja albumiini, , jotka ovat usein tärkeimmät palautuskohteet viljellyn lihan väliaineissa. Kemiallisesti vakaat transferriinin vaihtoehdot voivat vähentää eräkohtaisia vaihteluita ja helpottaa kierrätyssilmukan toimintaa.
Jos poistaminen on päätavoite, aloita yksinkertaisimmalla erotusvaiheella. Kalvomenetelmät - mikrofiltraatio, ultrasuodatus, tangentiaalivirtaussuodatus ja diafiltraatio - ovat käytännöllinen lähtökohta useimmille tiimeille. Jätä kromatografia, ioniselektiivinen erotus ja biologinen kiillotus tapauksiin, joissa kohdennettu poisto tai valikoiva palautus selvästi kattaa lisäprosessin aiheuttaman rasituksen.
Mitä tahansa tekniikoiden yhdistelmää käytätkin, prosessin validointi on ehdoton edellytys.Kierrätetyn median on osoitettava tukevan johdonmukaista solujen kasvua, säilyttävän fenotyyppisen identiteetin ja ylläpitävän erilaistumiskyvyn useiden passagien ajan. Vahvistuskriteerien tulisi sisältää:
- Solujen kaksinkertaistumisaika
- Pintamerkkien säilyminen
- Ravinteiden johdonmukaisuus
- Steriiliys
Kukin näistä tulisi tarkistaa seerumittomien medioiden kontrollien kanssa ennen kuin mikään kierrätetty erä hyväksytään uudelleenkäyttöön laajassa mittakaavassa.
Valitse yksinkertaisin strategia, joka poistaa mitatut pullonkaulat, sopii prosessitilaan ja validoi laajassa mittakaavassa.
UKK:t
Kuinka paljon käytettyä mediaa voidaan yleensä käyttää uudelleen?
Ei ole kiinteää prosenttiosuutta tai teollisuuden laajuista standardia sille, kuinka paljon käytettyä mediaa voidaan käyttää uudelleen viljellyn lihan tuotannossa.
Tässä vaiheessa suurin osa alan työstä on suunnattu muualle: käytetään vähemmän mediaa kokonaisuudessaan, vaihdetaan kalliita komponentteja ja parannetaan median käytön tehokkuutta prosessin aikana.
Jos tarkastelet medianhallinnan työnkulkuja,
Mikä on suurin riski median kierrätyksessä?
Suurin riski on kontaminanttien ja aineenvaihduntajätteen kertyminen. Kun solut kasvavat, ne kuluttavat keskeisiä ravintoaineita ja vapauttavat sivutuotteita, jotka voivat hidastaa kasvua ja vaikuttaa tuotteen laatuun.
Viljellyn lihan tuotannossa solujen ympäristön on pysyttävä johdonmukaisena ja turvallisena. Jos median laatu heikkenee, se voi heikentää sekä turvallisuutta että skaalausta.
Milloin proteiinit tulisi korvata eikä palauttaa?
Proteiinit tulisi korvata, ei palauttaa, kun suurimittakaavaisen palautuksen tai rekombinanttiproteiinien tuotannon vaatima aika, kustannukset ja laitoksen asennus ylittävät hyödyt.
Käytännössä korvaaminen on järkevää, kun edullisempi, vakaampi, ei-rekombinantti vaihtoehto voi tarjota saman biologisen toiminnon. Tämä on erityisen tärkeää kalliiden kasvatusalustojen syötteiden kohdalla. Transferriini voi esimerkiksi muodostaa jopa 95% kasvatusalustojen kustannuksista.
