La surveillance des cellules vivantes dans les bioréacteurs est essentielle pour la production de viande cultivée. L'extension nécessite des outils précis pour suivre la santé et la croissance des cellules en temps réel. Cet article passe en revue les méthodes clés, y compris les capteurs de capacitance, la spectroscopie Raman et la fluorescence, en soulignant leurs forces et leurs limites pour les applications industrielles.
Principaux enseignements:
- Capteurs de Capacitance: Mesurent en continu la densité des cellules viables. Efficace pour les cellules adhérentes mais sensible aux changements de taille des cellules.
- Spectroscopie Raman: Suit les métabolites comme le glucose et le lactate. Idéal pour les environnements aqueux mais nécessite une calibration complexe.
- Fluorescence: Surveille l'activité métabolique via les signaux NADH/NADPH. Rapide mais affectée par les signaux de fond du milieu.
Défis:
- Les tests traditionnels comme le Trypan Blue sont destructifs et lents.
- Les densités cellulaires élevées et les milieux complexes interfèrent avec les méthodes optiques.
- L'encrassement des capteurs et les besoins de calibration limitent l'efficacité.
Le choix de la bonne méthode dépend des exigences du processus, de l'échelle du bioréacteur et des besoins en stérilité. Pour les opérations à grande échelle, combiner plusieurs techniques donne souvent les meilleurs résultats.
Capteurs à base de capacité pour la densité cellulaire viable
Comment fonctionne la spectroscopie diélectrique
Les capteurs de capacité, également appelés capteurs d'impédance radiofréquence, traitent les cellules vivantes comme si elles étaient de minuscules condensateurs sphériques. Lorsqu'un champ électrique est appliqué à une suspension de cellules, les ions dans le milieu de culture et à l'intérieur du cytoplasme cellulaire commencent à se déplacer. Ils finissent par rencontrer la membrane plasmique non conductrice, provoquant la polarisation - une séparation des charges à travers la membrane [5][6].
Voici la clé : seules les cellules avec des membranes intactes peuvent se polariser. Les cellules mortes, qui n'ont pas de membranes intactes, ne peuvent pas piéger les ions et, par conséquent, ne contribuent pas au signal de capacitance [5][7]. John Carvell, Directeur des Ventes et du Marketing chez Aber Instruments Ltd., l'explique bien :
"L'impédance radiofréquence (RF)... est généralement considérée comme la méthode la plus robuste et fiable pour surveiller les concentrations de cellules vivantes dans la culture de cellules de mammifères." [5]
La spectroscopie diélectrique s'appuie sur cela en mesurant les propriétés diélectriques (ou permittivité) de la suspension cellulaire à travers diverses fréquences. Ce processus génère une courbe de dispersion β, illustrant comment la capacité des cellules à se polariser diminue à mesure que la fréquence du champ électrique augmente [6].Une lecture à fréquence unique reflète souvent le biovolume viable - le volume total occupé par les cellules vivantes - plutôt que simplement le nombre de cellules. Les cellules plus grandes contribuent naturellement plus au signal que les plus petites [5][6].
Ces principes forment l'épine dorsale de la technologie des capteurs de capacité, en faisant un outil précieux dans les systèmes de bioréacteurs.
Utilisation des Capteurs de Capacité dans les Bioréacteurs de Viande Cultivée
Les capteurs de capacité sont compatibles avec les systèmes de bioréacteurs à usage unique et multi-usage. Pour les configurations à usage unique, des disques de capteurs jetables peuvent être soudés dans des sacs en film flexible ou insérés à travers des ports de tube pré-équipés [5][9]. Dans les systèmes en acier inoxydable, des sondes réutilisables de 12 mm sont connectées via des ports stériles [9].
Un exemple pratique vient de l'Université d'Aix-la-Chapelle, où des chercheurs ont utilisé le système BioPAT ViaMass dans un bioréacteur à usage unique de 20 litres à mouvement de bascule pour surveiller les cellules CHO DG44. Ils ont obtenu une forte corrélation (coefficient de régression de 0,95) entre les lectures de capacitance et le volume total de cellules [5]. De même, Xpand Biotechnology aux Pays-Bas a utilisé des capteurs de biomasse Aber dans leur système d'expansion cellulaire Scinus pour suivre les cellules souches mésenchymateuses (CSM) cultivées sur des microporteurs à une densité de 60 g/L. Les capteurs ont efficacement tracé les profils de croissance sur des volumes allant de 150 mL à 1 litre, avec des résultats s'alignant étroitement avec les mesures de référence hors ligne [5].
Pour la production de viande cultivée, les capteurs de capacitance brillent lorsqu'ils travaillent avec des cellules adhérentes sur des microporteurs. Contrairement aux méthodes optiques, qui peuvent avoir des difficultés avec les supports solides, les capteurs de capacité peuvent pénétrer ces structures. Cette capacité les rend particulièrement utiles pour surveiller les cellules dépendantes de l'ancrage, un pilier de la fabrication de viande cultivée [8].
Forces et Faiblesses des Capteurs de Capacité
Les capteurs de capacité offrent des données continues et en temps réel sans les risques de contamination ou les retards associés à l'échantillonnage manuel. Ils sont actuellement les seuls outils en ligne disponibles dans le commerce pour évaluer la viabilité cellulaire dans les bioprocédés industriels [7]. Alors que les méthodes traditionnelles hors ligne comme les tests au bleu trypan ont une erreur relative d'environ 10%, le balayage de fréquence de capacité peut réduire cette erreur à entre 5,5% et 11% [6].
Cela dit, ces capteurs ont leurs limites.Les mesures à fréquence unique ne peuvent pas différencier entre une augmentation du nombre de cellules et une augmentation de la taille des cellules. Par exemple, si les cellules augmentent considérablement en diamètre pendant un cycle - que ce soit en raison du stress ou de la phase de mort - le signal pourrait mal représenter le nombre réel de cellules à moins qu'un balayage multi-fréquence ne soit utilisé [6]. De plus, les changements dans le milieu de suspension, tels que les ajouts d'alimentation ou les dilutions, peuvent provoquer des "creux" temporaires dans les données qui ne reflètent pas de réels changements de biomasse [5]. Dans les bioréacteurs à mouvement de bascule, le capteur peut momentanément rencontrer l'espace de tête gazeux, nécessitant des algorithmes de filtrage avancés pour éviter les interférences de signal [5].
Ces facteurs sont cruciaux lors de l'affinement de la surveillance des cellules vivantes pour la production de viande cultivée.
Méthodes de spectroscopie pour l'analyse des cellules vivantes
Spectroscopie Raman et NIR
La spectroscopie Raman utilise la diffusion inélastique de la lumière d'un laser de 785 nm pour générer une empreinte moléculaire, permettant la mesure simultanée de métabolites tels que le glucose, le lactate, la glutamine et l'ammonium. D'autre part, la spectroscopie NIR (800–2,500 nm) détecte les absorptions optiques des harmoniques et des bandes de combinaison [10][12][13][14]. La sensibilité minimale de Raman à l'eau le rend idéal pour les environnements aqueux comme les cultures cellulaires, tandis que la haute sensibilité de NIR à l'eau - en raison du fort signal d'étirement O–H - peut masquer des données biochimiques critiques [10][12][14].
En mars 2017, Lonza Biologics a comparé la NIR, la Raman et la fluorescence 2D dans des bioréacteurs miniatures de 15 mL (système ambr™). Ils ont trouvé que la Raman était la plus fiable pour mesurer le lactate et le glucose, tandis que la NIR était meilleure pour prédire les niveaux de glutamine et d'ions ammonium [10][11].
En avril 2022, des chercheurs de Sartorius Stedim Biotech ont intégré une cellule de flux Raman en ligne dans le flux de récolte sans cellules d'un processus de perfusion de cellules CHO. En utilisant un spectromètre Raman HyperFluxPRO avec un laser de 785 nm, ils ont réussi à obtenir un contrôle automatisé du retour d'information sur le glucose, maintenant les concentrations à 4 g/L et 1,5 g/L avec une variabilité de ±0,4 g/L sur plusieurs jours [13]. J.Lemke de Sartorius Stedim Biotech a noté :
"Les résultats démontrent le potentiel élevé de la spectroscopie Raman pour la surveillance et le contrôle avancés d'un processus de perfusion avec un bioréacteur et une méthode de mesure indépendante de l'échelle." [13]
En mai 2011, Bristol-Myers Squibb a utilisé une sonde Raman en ligne dans des bioréacteurs de 500 litres pour surveiller plusieurs paramètres, y compris la glutamine, le glutamate, le glucose, le lactate, l'ammonium, la densité cellulaire viable (VCD) et la densité cellulaire totale (TCD). Les spectres ont été collectés toutes les deux heures avec un instrument RamanRXN3 de Kaiser Optical Systems, démontrant la capacité de Raman à suivre les augmentations de nutriments et les diminutions de métabolites lors des ajouts d'alimentation dans la fabrication à grande échelle [14].
Alors que la spectroscopie Raman et NIR fournissent des informations chimiques détaillées, les méthodes de fluorescence et UV-Vis offrent des perspectives complémentaires sur le métabolisme cellulaire et la biomasse.
Spectroscopie de Fluorescence et UV-Vis
La spectroscopie UV-Vis mesure l'absorbance ou la diffusion de la lumière pour estimer la biomasse totale [16]. Cette méthode simple et largement utilisée, cependant, a du mal à différencier les cellules viables des cellules mortes et devient moins précise à des densités cellulaires plus élevées [16].
La fluorométrie, qui est plus sensible que l'UV-Vis, se concentre sur des marqueurs intracellulaires spécifiques comme le NADH et le NADPH, indicateurs de l'activité métabolique. La fluorométrie in situ utilise une lumière ultraviolette de 366 nm pour exciter le NADH/NADPH, qui fluoresce ensuite autour de 460 nm [16].Veer Pramod Perwez explique:
"La seule stratégie de surveillance continue développée jusqu'à présent qui fournit des informations sur l'état biochimique ou métabolique de la population cellulaire est la fluorométrie in situ." [16]
Dans la production de viande cultivée, où les données en temps réel sont essentielles, la fluorescence offre un retour rapide sur les changements métaboliques, tandis que l'UV-Vis propose un moyen économique d'estimer la biomasse. La fluorescence peut suivre les changements métaboliques et détecter l'épuisement du substrat en temps réel en surveillant les niveaux de NADH. Par exemple, dans une étude, la fluorescence 2D a mesuré les concentrations d'ammonium avec un RMSECV de 0,031 g/L, surpassant à la fois le Raman et le NIR dans des configurations de bioréacteurs miniatures [11]. De plus, les plateformes microfluidiques automatisées peuvent combiner la microscopie en champ clair (pour mesurer la concentration totale de cellules) avec la détection par fluorescence utilisant l'iodure de propidium, déterminant la viabilité cellulaire en seulement 10.3 minutes [15].
Comparaison des différentes méthodes de spectroscopie
Lors de la comparaison de ces techniques, chacune a des forces distinctes pour la surveillance des bioréacteurs. Le Raman se distingue par sa capacité à prédire le glucose, le lactate et les titres d'anticorps, grâce à son empreinte moléculaire et à sa faible interférence avec l'eau [10][11]. Le NIR, malgré sa sensibilité à l'eau, est plus efficace pour surveiller la glutamine et l'ammonium [10][12]. La fluorescence fournit des informations détaillées sur l'activité métabolique et la viabilité, tandis que l'UV-Vis reste un choix simple et économique pour estimer la biomasse totale [16].
L'analyse multivariée améliore l'interprétation des spectres complexes, permettant la surveillance simultanée de plusieurs analytes [10][13][14]. Pour la production de viande cultivée, le choix de la méthode de spectroscopie appropriée dépend des métabolites à surveiller, de l'échelle du bioréacteur et de l'utilisation de systèmes à usage unique ou multiple. Ces techniques permettent collectivement une surveillance précise des cellules, la compatibilité de Raman avec les environnements aqueux et ses capacités multi-analytes le rendant particulièrement attrayant pour les opérations à grande échelle [13][14].
Culture de cellules de mammifères - Raman comme moyen de surveillance &et de contrôle des bioprocédés en amont
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Méthodes avancées pour la physiologie et la viabilité des cellules
En plus de la spectroscopie, des techniques de pointe offrent des perspectives plus profondes sur la physiologie et la viabilité des cellules.
FTIR pour la surveillance de la viabilité cellulaire et de l'apoptose
La spectroscopie FTIR utilise les vibrations moléculaires dans les protéines, les lipides et les glucides pour détecter le stress nutritionnel et l'apoptose précoce, deux marqueurs critiques de la santé cellulaire déclinante dans les bioréacteurs de viande cultivée.
Une approche, ATR-FTIR (réflexion totale atténuée), analyse la variabilité spectrale dans les régions à haute fréquence pour différencier les cellules saines des cellules carencées en nutriments. En mai 2024, des chercheurs de Dxcover Ltd.employé une plateforme ATR-FTIR équipée d'éléments de réflexion interne (IRE) jetables pour surveiller la santé des cellules CHO. En utilisant l'analyse en composantes principales (PCA), ils ont réussi à distinguer les cellules saines de celles déficientes en nutriments dans l'espace PC. La plateforme a atteint des valeurs R² multi-sorties impressionnantes proches de 0,98 pour le glucose et l'acide lactique, offrant des informations en temps réel sur la viabilité cellulaire [17]. Étant donné que l'accumulation d'acide lactique peut entraîner la mort cellulaire, cette surveillance en temps réel permet des interventions opportunes pour maintenir la santé cellulaire.
Les systèmes FTIR modernes sont conçus avec des IRE jetables ou des sondes immergées pour une intégration directe dans les environnements de bioréacteurs. Cette configuration fournit non seulement des données en temps réel, mais réduit également les risques de contamination [17].Comme souligné dans Frontiers in Bioengineering and Biotechnology:
"Les technologies basées sur la spectroscopie sont bien adaptées en tant qu'approches PAT car elles sont non destructives et nécessitent une préparation minimale des échantillons." [17]
En élargissant ces capacités, le balayage par capacité multi-fréquence aborde les limitations des méthodes à fréquence unique.
Balayage par Capacité Multi-Fréquence
Bien que les capteurs de capacité à fréquence unique soient utiles pour mesurer le volume cellulaire viable (VCV), ils ont du mal à distinguer entre les changements de taille et de nombre de cellules. Cette limitation devient particulièrement problématique lors de l'apoptose, lorsque les diamètres cellulaires augmentent souvent [18].La numérisation de la capacitance multi-fréquence résout ce problème en mesurant la permittivité sur une plage de 50 à 20 000 kHz, capturant la courbe de dispersion β pour évaluer avec précision les concentrations cellulaires viables indépendamment des variations de taille [18].
En octobre 2019, des chercheurs de Sartorius Stedim Biotech ont utilisé une sonde FUTURA pico d'Aber Instruments pour surveiller les cellules DG44 CHO dans des bioréacteurs de 250 mL. En appliquant la modélisation par moindres carrés partiels orthogonaux (OPLS) à 25 fréquences distinctes, ils ont réduit les erreurs de prédiction de la VCC à seulement 5,5 % à 11 %, une amélioration significative par rapport aux taux d'erreur de 16 % à 23 % observés avec des mesures à fréquence unique [18]. Le modèle a suivi efficacement les concentrations cellulaires dépassant 10 millions de cellules/mL et a rapidement identifié les écarts causés par les changements de dilution et d'alimentation, avec des marges d'erreur de 6,7 % à 13.2% [18].
La fréquence caractéristique (fC), qui indique le point où la polarisation cellulaire est à moitié complète, varie en fonction de la taille et de la polarisabilité des cellules. Cela fournit un marqueur supplémentaire pour les changements physiologiques, en particulier pendant la phase de mort cellulaire lorsque la morphologie subit des transformations notables [18]. Comme l'explique Analytical and Bioanalytical Chemistry:
"Les influences de VCC et du diamètre cellulaire sur le signal de permittivité ne sont pas distinguables avec une seule mesure de fréquence." [18]
Comparaison des méthodes analytiques pour la surveillance des cellules vivantes
Comparaison des méthodes analytiques pour la surveillance des cellules vivantes dans les bioréacteurs
Cette section examine de plus près les principales méthodes analytiques utilisées pour la surveillance des cellules vivantes dans les bioréacteurs de viande cultivée, en s'appuyant sur les techniques avancées précédemment discutées.
Le choix de la meilleure méthode implique de trouver un équilibre entre précision, rapidité et praticité. Chaque technique offre des forces distinctes, qu'il s'agisse de suivre la densité cellulaire viable, de surveiller l'activité métabolique ou de maintenir la stérilité dans les systèmes à usage unique.
Les capteurs basés sur la capacitance sont actuellement la seule option en ligne disponible dans le commerce adaptée à la surveillance de la viabilité [7].Ces capteurs mesurent le volume cellulaire viable en détectant la polarisation des cellules avec des membranes intactes dans un champ électrique alternatif. Alors que les systèmes à fréquence unique peuvent avoir des difficultés avec la précision lorsque les tailles cellulaires varient, le balayage multi-fréquence améliore considérablement la précision, atteignant des marges d'erreur de 5,5 % à 11 % [18].
Méthodes spectroscopiques - telles que la spectroscopie Raman, NIR et de fluorescence - offrent une vue plus complète de l'activité métabolique, suivant plusieurs paramètres en plus de la biomasse. Ces méthodes sont non-invasives, ce qui les rend idéales pour les bioréacteurs à usage unique où la stérilité est cruciale. Cependant, elles présentent des défis : les systèmes spectroscopiques nécessitent une calibration approfondie avec des modèles chimiométriques et impliquent souvent des coûts initiaux plus élevés par rapport aux sondes de capacité.
La spectroscopie FTIR est particulièrement efficace pour détecter les premiers signes d'apoptose et de stress nutritionnel grâce à l'analyse des vibrations moléculaires. Cependant, sa forte absorption d'eau limite son utilité pour une surveillance continue en ligne dans des environnements aqueux [7]. Au lieu de cela, la FTIR fonctionne mieux comme méthode à la ligne, surtout lorsqu'elle est associée à une analyse multivariée pour le suivi en temps réel des métabolites.
Tableau de comparaison des méthodes analytiques
| Méthode | Capacité en temps réel | Compatibilité avec le bioréacteur | Besoins en étalonnage | Principales limitations |
|---|---|---|---|---|
| Capteurs de capacitance | Oui (En ligne/Sur ligne) | Élevée (Agité, Bascule, SUBs) | Faible à modérée | Sensible aux bulles de gaz et aux changements de taille/morphologie des cellules |
| Spectroscopie Raman | Oui (En ligne) | Modérée (Nécessite un port de sonde) | Élevée (Chimiométrie) | Coût élevé de l'équipement ; interprétation complexe des données |
| Spectroscopie NIR | Oui (En ligne/À la ligne) | Élevée | Élevée (Multivariée) | Sensibilité à l'interférence de l'eau et aux changements de milieu |
| Fluorescence | Oui (En ligne) | Élevée | Modérée | Fluorescence de fond du milieu ; photoblanchiment |
| FTIR | Oui (À la ligne) | Modérée | Élevée | Forte absorption de l'eau limite l'utilisation en ligne dans les milieux aqueux |
Pour la production de viande cultivée, où la précision et la fiabilité sont non négociables, adapter les méthodes analytiques aux exigences spécifiques du processus est essentiel pour atteindre des performances optimales du bioréacteur.Les plateformes comme
Conclusion et Recommandations
La sélection de la méthode analytique appropriée implique de concilier les exigences du processus avec des facteurs tels que l'échelle, le coût et les exigences réglementaires. Votre choix dépendra de considérations clés telles que si vos cellules sont adhérentes ou adaptées à la suspension, la fréquence de surveillance nécessaire, et le niveau d'invasivité tolérable tout en garantissant que la stérilité reste intacte [1]. Avec les demandes substantielles en cellules pour la production de viande cultivée [1], la précision dans la surveillance est non négociable.
Facteurs Clés pour le Choix des Méthodes Analytiques
La surveillance en temps réel devrait être une priorité absolue.Les systèmes en ligne permettent la collecte de données in situ sans retirer d'échantillons, les rendant plus efficaces et moins sujets aux erreurs par rapport aux méthodes hors ligne, qui sont intensives en main-d'œuvre et risquent la contamination [3][1]. Pour les bioréacteurs à grande échelle - jusqu'à 2 000 litres ou plus - des techniques non invasives comme la spectroscopie Raman ou NIR sont particulièrement utiles. Ces méthodes sont sans réactifs et peuvent suivre plusieurs paramètres, tels que le glucose, le lactate et les acides aminés, simultanément [1][3]. Cette capacité multivariée réduit non seulement les coûts de surveillance mais maintient également l'environnement stérile et de qualité alimentaire nécessaire pour la conformité réglementaire [19].
La sensibilité et la plage dynamique sont tout aussi importantes lors de l'analyse de milieux biologiques complexes.Les essais basés sur la luminescence offrent généralement une sensibilité plus élevée que les méthodes de fluorescence ou d'absorbance [2]. Pendant ce temps, les techniques spectroscopiques avancées génèrent des ensembles de données complexes qui nécessitent souvent des outils d'apprentissage automatique ou chimiométriques pour une analyse appropriée [3][1]. Pour une solution plus simple, les capteurs basés sur la capacitance sont efficaces pour surveiller la viabilité cellulaire.
La scalabilité et la conformité réglementaire sont essentielles pour la production commerciale. Les capteurs dans ces environnements doivent supporter la stérilisation à haute température, minimiser la lixiviation et fonctionner pendant de longues périodes sans nécessiter de recalibrage. Les systèmes de suivi automatisés basés sur l'image peuvent également fournir une documentation horodatée et prête pour l'audit, ce qui est crucial pour les soumissions réglementaires auprès d'organismes comme la FDA et l'EMA [4].Ces exigences soulignent l'importance de se procurer le bon équipement auprès de fournisseurs spécialisés.
Rationalisation de l'approvisionnement en équipements avec Cellbase
Compte tenu des complexités techniques et réglementaires, trouver le bon équipement analytique est crucial. Les plateformes de laboratoire générales manquent souvent de l'expertise adaptée à l'industrie de la viande cultivée.
FAQ
Quels sont les avantages de l'utilisation de capteurs de capacité dans les bioréacteurs pour la production de viande cultivée ?
Les capteurs de capacité offrent un moyen en temps réel et non intrusif de mesurer la biomasse cellulaire viable dans les bioréacteurs. Ils fournissent des données précises et fiables sans interrompre le processus, ce qui en fait un choix e
Ces capteurs fonctionnent parfaitement sur des systèmes de toutes tailles, des petites installations aux grands bioréacteurs industriels à usage unique. Cette flexibilité améliore la gestion des processus, minimise la dépendance à l'échantillonnage hors ligne et rationalise les flux de travail de production.En offrant des informations détaillées sur l'activité cellulaire, les capteurs de capacité jouent un rôle clé dans l'amélioration des bioprocédés, en particulier pour la production de viande cultivée.
Quels sont les avantages de la spectroscopie Raman pour surveiller les métabolites cellulaires dans les bioréacteurs ?
La spectroscopie Raman permet le suivi en temps réel et non invasif des métabolites cellulaires cruciaux directement dans les bioréacteurs. Cette approche élimine le besoin de prélever des échantillons, réduisant ainsi considérablement le risque de contamination. Elle peut mesurer simultanément une gamme de composés, tels que le glucose, le lactate, l'ammonium et les titres de produits, ce qui en fait un outil efficace pour des processus prolongés comme les cycles de perfusion.
Comparée à d'autres méthodes, la spectroscopie Raman offre souvent une précision plus élevée pour les métabolites clés comme le glucose et le lactate. Elle peut même surpasser des techniques telles que l'infrarouge proche (NIR) et la fluorescence 2D dans certaines conditions.Contrairement aux méthodes hors ligne traditionnelles, telles que la CLHP ou les dosages colorimétriques, la spectroscopie Raman fonctionne en continu, réduisant le temps et l'utilisation des ressources tout en préservant l'intégrité de la culture cellulaire.
Dans la production de viande cultivée, la spectroscopie Raman se distingue par sa compatibilité avec les bioréacteurs compacts et sa capacité à fournir des mesures fiables sans étalonnage. Pour ceux qui ont besoin d'outils de surveillance basés sur Raman,
Quels sont les défis de l'utilisation des méthodes optiques dans les bioréacteurs à haute densité cellulaire ?
Dans les environnements à haute densité cellulaire, les méthodes optiques rencontrent des défis tels que l'augmentation de la diffusion de la lumière et la turbidité du milieu, qui peuvent fausser les mesures. Ajoutant à la complexité, l'accumulation de débris cellulaires peut affaiblir les signaux et provoquer des réponses non linéaires, rendant les lectures précises encore plus difficiles à obtenir.
Ces problèmes sont particulièrement problématiques dans les bioréacteurs, où les conditions changent constamment et sont complexes. Pour surmonter ces limitations et maintenir une surveillance fiable, des techniques analytiques plus sophistiquées peuvent être nécessaires.
