Jeśli porównujesz wartości kLa bez dopasowania metody, medium, temperatury i reakcji sondy, możesz podjąć błędną decyzję dotyczącą skalowania.
Dla inżynierów bioprocesów, naukowców zajmujących się hodowlą komórek i zespołów R&D zajmujących się mięsem hodowlanym, krótka odpowiedź jest prosta: statyczne odgazowanie jest najlepsze do porównywania naczyń, podczas gdy dynamiczne i równowaga tlenu w gazach wylotowych są bardziej przydatne, gdy chcesz uzyskać dane dotyczące procesu w warunkach żywego bulionu. Wartości kLa oparte na wodzie mogą wprowadzać w błąd, opóźnienie sondy może zniekształcać szybkie tempo transferu, a dodatki do mediów, takie jak Pluronic F-68 mogą obniżyć kLa o 50% lub więcej w niektórych konfiguracjach.
Oto artykuł w jednym przejściu:
- kLa nie jest celem samym w sobie. Używałbym go razem z P/V, ograniczeniami ścinania, przepływem gazu i czasem mieszania.
- Statyczne odgazowanie zapewnia czyste porównanie sprzętu, ale ignoruje Nasz i nie odzwierciedla aktywnej kultury.
- Metody dynamiczne śledzą transfer tlenu podczas kultury i są bliższe temu, co stosuje się na dużą skalę, choć przerwa w napowietrzaniu może stresować komórki.
- Metody bilansu tlenowego wykorzystują dane o gazach wlotowych i wylotowych i są odpowiednie dla większych naczyń, ale wymagają dokładnej analizy gazów.
- Utlenianie siarczynów i metody stopniowego ciśnienia są głównie do charakteryzacji sprzętu, a nie do żywego bulionu mięsnego.
- Czas reakcji sondy ma znaczenie: optyczne sondy DO często reagują w 3-10 s , podczas gdy sondy polarograficzne często 8-30 s.
- Temperatura i medium mają znaczenie: kLa zmierzone w wodzie przy 20°C nie przekłada się bezpośrednio na medium kulturowe przy 37°C .
- Typowe zgłaszane zakresy w artykule to 50-200 h⁻¹ przy 2-10 L i 80-300 h⁻¹ przy 50-500 L, ale tylko wtedy, gdy pełna podstawa testu się zgadza.
H.E.L Wyjaśnia | Osiąganie Spójnego Transferu Tlenu: Wpływ kLa na Skalowanie Fermentacji
sbb-itb-ffee270
Szybkie Porównanie
Metody Pomiaru kLa dla Skalowania Bioreaktorów: Porównanie Bok w Bok
| Metoda | Najlepsze dla | Główna wada | Dopasowanie procesu |
|---|---|---|---|
| Statyczne odgazowanie | Porównanie naczynia i dyfuzora | Brak zapotrzebowania na tlen przez żywe komórki | Niskie do średniego |
| Metoda dynamiczna | Praca nad skalowaniem aktywnej kultury | Zatrzymanie napowietrzania może zakłócić komórki | Wysokie |
| Bilans tlenowy | Monitorowanie na większą skalę | Wymaga dokładnych danych z gazów wylotowych | Wysokie |
| Utlenianie siarczynów | Maksymalne kontrole sprzętu transferowego | Nie jak media procesowe | Niskie |
| Krok ciśnienia | Charakterystyka dużych zbiorników | Wymaga instalacji o odpowiednim ciśnieniu | Średnie |
Gdybym opracowywał plan zwiększenia skali, szczególnie przy przechodzeniu na systemy w skali pilotażowej, traktowałbym wybór metody jako część kontroli jakości danych, nie jako późniejszą myśl.
2. Główne metody pomiaru kLa stosowane w badaniach bioreaktorów
Literatura zazwyczaj grupuje pomiary kLa w trzy główne rodziny metod: statyczne odgazowanie, dynamiczne i metody bilansu tlenowego, oraz techniki chemiczne lub oparte na ciśnieniu. Każda z nich analizuje transfer tlenu z nieco innej perspektywy. To ma znaczenie, ponieważ sama metoda może wpływać na interpretację danych dotyczących skalowania.
2.1 Statyczne odgazowanie
Statyczne odgazowanie rozpoczyna się od odtlenienia cieczy, najczęściej za pomocą azotu. Następnie włącza się napowietrzanie i śledzi się odzyskiwanie rozpuszczonego tlenu (DO) w czasie. kLa jest obliczane na podstawie tempa wzrostu DO.
Ponieważ nie wymaga żywych komórek ani niebezpiecznych odczynników, ta metoda jest prostym sposobem na ocenę bioreaktora. Problem polega na tym, że nie odzwierciedla oddychania komórek ani zmian właściwości bulionu podczas wzrostu kultury. Wyniki zależą również od medium, konstrukcji wirnika, konstrukcji spargera, przepływu gazu, temperatury i użycia środka przeciwpieniącego. Na przykład w mieszanym zbiorniku o pojemności 400 L dodanie Pluronic F-68 w ilości 0,02 g/L może zmniejszyć kLa o co najmniej 50% w porównaniu z odniesieniem bez dodatku [2].
Jednym z praktycznych problemów jest dynamika sondy. Jeśli reakcja czujnika jest zbyt wolna, zmierzony kLa jest zniekształcony i wymaga korekty [1].
2.2 Metody dynamiczne i bilansu tlenowego w warunkach procesowych
Jeśli celem jest znaczenie procesowe, a nie punkt odniesienia dla czystej wody, metody dynamiczne zazwyczaj dostarczają więcej informacji. W najczęstszej wersji napowietrzanie jest na krótko zatrzymywane, aby oddychanie komórek obniżyło poziom DO. Następnie napowietrzanie jest przywracane, a przejściowy proces odzyskiwania jest analizowany. To sprawia, że pomiar jest znacznie bliższy temu, co dzieje się z bulionem podczas rzeczywistego przebiegu.
Metoda bilansu tlenowego podąża inną drogą.Zamiast przerywać napowietrzanie, szacuje kLa z OTR minus OUR, zazwyczaj za pomocą analizy gazów wylotowych, takiej jak spektrometria masowa [2]. Jest to metoda nieinwazyjna i szczególnie przydatna w większych naczyniach. Ale jest pewien koszt: potrzebujesz oprogramowania do kontroli bioprocesów oraz sprzętu do analizy gazów wylotowych i wiarygodnych danych OUR.
W pracy nad mięsem hodowlanym te metody są przydatne, ponieważ odzwierciedlają transfer tlenu w tych samych warunkach bulionu i komórek, które występują podczas skalowania. Kompromis jest dość oczywisty. W metodzie dynamicznej, DO spada podczas przerwy w napowietrzaniu, co może stresować kulturę, jeśli przerwa trwa zbyt długo.
Metody chemiczne i ciśnieniowe są częściej używane do charakteryzacji sprzętu niż do odczytu procesów na żywo.
2.3 Metody utleniania siarczynów i ciśnieniowe
Do niebiologicznych testów porównawczych często pojawiają się dwie inne metody.Są dobre do charakteryzowania sprzętu, ale nie reprezentują bezpośrednio żywego bulionu z mięsa hodowanego.
Utlenianie siarczynów wykorzystuje siarczyn sodu, utleniany w obecności katalizatora, do zużywania rozpuszczonego tlenu w tempie, z którego można obliczyć kLa. Problem jest prosty: ciecz nie jest reprezentatywna dla mediów biologicznych, więc wynik nie przekłada się bezpośrednio na bulion z mięsa hodowanego [2].
Metoda zmiany ciśnienia zmienia ciśnienie w naczyniu w sposób stopniowy, aby przesunąć stężenie nasycenia tlenem (C*) zgodnie z prawem Henry'ego. Tworzy to siłę napędową transferu masy bez zmiany prędkości mieszania lub przepływu gazu [2]. Jest przydatna, gdy łatwiej jest kontrolować ciśnienie niż mieszanie lub napowietrzanie. Mimo to wymaga naczyń odpornych na ciśnienie i ściśle kontrolowanych zmian ciśnienia, co ogranicza codzienne użytkowanie. Niemniej jednak pozostaje użyteczną metodą badawczą do charakteryzacji sprzętu.
3. Mocne strony, ograniczenia i porównywalność metod
Opublikowane wartości kLa są porównywalne tylko wtedy, gdy konfiguracja testu i założenia podstawowe są takie same. Nawet temperatura może znacząco wpłynąć na wynik. A jeśli jeden artykuł uwzględnia czas reakcji sondy tlenowej, a inny nie, te wartości nie powinny być traktowane jako równoważne, nawet jeśli reszta konfiguracji wygląda tak samo.
Ta różnica ma największe znaczenie, gdy decydujesz, jaka jest liczba dla. Czy jest to benchmark sprzętowy? Czy jest to metryka procesowa, która odzwierciedla to, co dzieje się w kulturze?
3.1 Gdzie statyczne odgazowanie pozostaje metodą referencyjną
Statyczne odgazowanie jest nadal preferowaną metodą do porównania sprzętu. Jeśli celem jest porównanie projektów dyfuzorów, geometrii mieszadeł lub konfiguracji naczyń w kontrolowanych warunkach, metoda ta sprawdza się dobrze.Jest to proste, powtarzalne i nie wymaga żywych komórek.
Wadą jest równie oczywiste: kLa mierzony w wodzie jest słabym predyktorem transferu tlenu w pożywkach do hodowli mięsa. Wartość z wody dejonizowanej mówi coś użytecznego o samym naczyniu, ale znacznie mniej o wydajności, gdy w grę wchodzi rzeczywiste medium.
W tym miejscu metody dynamiczne zaczynają mieć większe znaczenie. Gdy praca przesuwa się z charakterystyki naczynia na żywą kulturę, znaczenie procesu zaczyna przeważać nad kontrolą czystego systemu.
3.2 Gdzie metody dynamiczne i profile rozpuszczonego tlenu dodają znaczenia procesowi
Metody dynamiczne są bliższe rzeczywistym warunkom procesu, ponieważ mierzą transfer tlenu podczas aktywnej hodowli. Oznacza to, że uchwytują zarówno zapotrzebowanie na tlen, jak i rzeczywiste właściwości bulionu. Dla pracy nad skalowaniem, to sprawia, że wynik jest znacznie bardziej użyteczny niż oszacowanie w czystej wodzie.
Metoda równowagi tlenowej dodaje ciągły, nieinwazyjny odczyt w warunkach operacyjnych, choć zależy od dokładnej analizy gazów wylotowych i stabilnej pracy [2].
Różnice są łatwiejsze do zauważenia, gdy metody są zestawione obok siebie.
3.3 Tabela porównawcza: metoda odpowiednia do skalowania mięsa hodowlanego
| Metoda | Zasada | Wymagane dane | Główne założenia | Mocne strony | Ograniczenia | Najlepsze zastosowanie |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Statyczne odgazowywanie | Wzrost DO po usunięciu N₂ w cieczy bezkomórkowej | Przebieg czasowy DO, czas reakcji sondy | Dobrze wymieszana ciecz; brak OUR | Prosta; powtarzalna; nie wymaga komórek | Ignoruje OUR; wrażliwa na skład pożywki i opóźnienie sondy | Początkowa charakterystyka naczynia; porównanie sprzętu |
| Metoda dynamiczna | Odzyskiwanie DO podczas aktywnej kultury po krótkim zatrzymaniu napowietrzania | Przebieg czasowy DO, szacowanie OUR | Kultura w stanie quasi-stacjonarnym; zastosowano korekcję czujnika | Odwzorowuje rzeczywiste warunki bulionu i komórek | Przerwa w napowietrzaniu może stresować kulturę; wrażliwa na opóźnienie czujnika | Optymalizacja procesu i skalowanie podczas aktywnego wzrostu |
| Równowaga tlenowa (analiza fazy gazowej) | Bilans masy O₂ między gazem wlotowym a wylotowym | Dokładne przepływy gazu i stężenia O₂ | Stabilna operacja | Nieinwazyjne; ciągłe; bez zakłóceń kultury | Wymaga bardzo dokładnej analizy gazów wylotowych | Monitorowanie produkcji na dużą skalę |
| Utlenianie siarczynów | Utlenianie chemiczne siarczynu sodu zużywa O₂ | Szybkość zużycia siarczynów | Szybkość reakcji ograniczona przez przenoszenie masy | Przydatne dla maksymalnej pojemności OTR | Nie reprezentuje mediów biologicznych; może przeszacować kLa | Tylko do benchmarkingu sprzętu; nie do pracy z żywymi kulturami |
| Metoda dynamicznego ciśnienia (DPM) | Zmiana ciśnienia w celu zmiany rozpuszczalności tlenu | Przebieg czasowy ciśnienia i DO | Ciśnienie wyrównuje się szybciej niż skład gazu | Unika opóźnienia fazy gazowej; odpowiednia dla dużych zbiorników | Wymaga zbiornika o podwyższonej wytrzymałości na ciśnienie i precyzyjnej kontroli ciśnienia | Charakterystyka na dużą skalę |
Te wybory metod wpływają na to, jak dane kLa powinny być przekształcane w cele skalowania i wybór sprzętu.
4. Wykorzystanie danych kLa w skalowaniu i wyborze sprzętu
4.1 Ustalanie celów skalowania z laboratorium do skali pilotażowej
Gdy już zmierzysz kLa, kolejnym zadaniem jest przekształcenie tej liczby w granice operacyjne dla mieszania, przepływu gazu i mieszania. kLa powinno być traktowane jako jedno ograniczenie, nie cała decyzja. Musi być wystarczająco wysokie, aby zaspokoić zapotrzebowanie na tlen, ale nie tak wysokie, aby proces przeszedł w reżim ścinania, którego twoje komórki nie będą tolerować.
Ta równowaga ma znaczenie w hodowanym mięsie. Utrzymywanie stałego kLa na większą skalę może prowadzić do wyższych prędkości końcówek wirnika, a z tym do wyższego ścinania [4]. W hodowli komórek ssaków, prędkości końcówek wirnika 0,1-0,5 m/s są często stosowane, aby zrównoważyć transfer tlenu z naprężeniem ścinającym [5]. W praktyce kLa znajduje się w szerszym oknie operacyjnym, które obejmuje również moc na jednostkę objętości (P/V), powierzchniową prędkość gazu oraz czas mieszania [4][5] .
Przydatnym punktem odniesienia jest tutaj. W reaktorze mieszalnikowym o pojemności 2-10 L w skali laboratoryjnej, kLa często mieści się w zakresie 50-200 h⁻¹. W zbiorniku pilotażowym o pojemności 50-500 L typowy zakres to 80-300 h⁻¹ [4] . Kluczowym krokiem jest znalezienie wspólnego zakresu, który wszystkie zbiorniki mogą osiągnąć. To właśnie przekształca cel skali z ładnego pomysłu na papierze w coś, co można uruchomić.
4.2 Wybór czujników i sprzętu do niezawodnej pracy z kLa
Dobre dane do skalowania zaczynają się od instrumentów i sprzętu gazowego, które nie zniekształcają wyniku.
Czas reakcji czujnika ma bezpośredni wpływ na dokładność kLa.W systemach o wysokim kLa używaj sond DO o szybkim czasie reakcji. Wolne sondy polarograficzne wymagają korekty i mogą zaniżać kLa. Sondy polarograficzne zazwyczaj mają czas reakcji 8-30 sekund, podczas gdy sondy oparte na fluorescencji optycznej reagują w 3-10 sekund [4]. Dobrą zasadą jest, aby czas reakcji sensora był mniejszy niż jedna dziesiąta stałej czasu przenoszenia masy (1/kLa) [1]. Jeśli nie możesz spełnić tego warunku, sondy optyczne są zazwyczaj bezpieczniejszą opcją.
Dostarczenie gazu jest równie ważne. Termiczne kontrolery przepływu masowego pomagają utrzymać stabilny przepływ gazu, co sprawia, że pomiary są bardziej powtarzalne. Wybór dyfuzora również ma bezpośredni wpływ na kLa, które można osiągnąć [2][3]. Mniejsze bąbelki zapewniają większą powierzchnię międzyfazową gaz-ciecz, ale jest haczyk: dodatki do mediów mogą znacznie obniżyć kLa [2].
5. Kluczowe wnioski dotyczące interpretacji pomiarów kLa
W sumie, wybrana metoda powinna odpowiadać na pytanie dotyczące skalowania, na które próbujesz odpowiedzieć. W praktyce oznacza to jasność, czy potrzebujesz charakterystyki sprzętu czy danych dotyczących skalowania procesu.
Wartość kLa mierzona w wodzie w temperaturze 20°C nie może być bezpośrednio przeniesiona do mediów hodowlanych w temperaturze 37°C. Sama korekta temperatury powoduje około 45% różnicy [4]. A kLa nie jest czymś, co można przewidzieć wyłącznie na podstawie teorii. Każdy bioreaktor potrzebuje swojego własnego zmierzonego kLa [1].
Ma to jeszcze większe znaczenie, gdy przechodzisz z skali laboratoryjnej do pilotażowej . Statyczne odgazowanie w buforze dopasowanym do soli, takim jak PBS, daje czysty punkt odniesienia dla sprzętu. Jednak wraz ze wzrostem skali, dynamiczne pomiary w rzeczywistym medium hodowlanym mówią więcej o tym, co proces będzie robił w praktyce, ponieważ dodatki do mediów mogą znacznie przesunąć kLa [4]. Jeśli polegasz na wartościach opartych na wodzie, możesz skończyć z nadmiernym określeniem zdolności transferu tlenu na dużą skalę.
Ostatnim sprawdzeniem jest, czy kLa mieści się w pełnym oknie operacyjnym. Traktuj kLa jako jedno z ograniczeń procesu, a nie jako cel sam w sobie. Używaj go razem z P/V i limitami ścinania przy wyborze najlepszego systemu bioreaktora i strategii mieszania [4] .
Najczęściej zadawane pytania
Jaką metodę kLa powinienem użyć do skalowania?
Metoda dynamicznego odgazowywania jest najczęściej stosowaną metodą do określania kLa w bioreaktorach z mieszadłem, i to jest metoda, którą większość zespołów poleca w praktyce. Jest dość szybka i unika potrzeby stosowania niebezpiecznych chemikaliów lub żywych organizmów.
W przypadku skalowania produkcji mięsa hodowanego najlepiej jest mierzyć bez komórek, aby metabolizm komórek nie zniekształcał wyniku. Użyj buforu PBS w temperaturze 37 °C , aby lepiej dopasować się do medium procesowego. A jeśli sonda tlenu rozpuszczonego ma wolny czas reakcji, zastosuj korektę. Jeśli tego nie zrobisz, możesz zaniżyć kLa .
Dlaczego wartości kLa oparte na wodzie są często mylące?
Wartości kLa oparte na wodzie mogą być mylące, ponieważ nie odzwierciedlają fizykochemicznego zachowania rzeczywistych mediów hodowli komórkowej.Prawdziwe media to nie tylko woda z mieszanką składników odżywczych. Stężenie soli, lepkość, napięcie powierzchniowe i środki przeciwpieniące wpływają na transfer masy tlenu w sposób, którego testy wodne nie pokażą.
Ta luka ma znaczenie. Jeśli zignorujesz efekty mediów, twoje szacunki dostarczania tlenu mogą znacznie odbiegać od tego, co faktycznie dzieje się w bioreaktorze. Dobrym przykładem jest środek przeciwpieniący: może zwiększać koalescencję bąbelków, zmniejszać powierzchnię międzyfazową i obniżać kLa nawet o 50%. W produkcji mięsa hodowlanego to nie jest mały szczegół. Może to zmienić, czy proces ma wystarczający zapas transferu tlenu, czy działa bliżej swojego limitu.
Jak opóźnienie sondy i dodatki do mediów wpływają na kLa?
Opóźnienie sondy może zniekształcać pomiary kLa . Jeśli czujnik tlenu rozpuszczonego reaguje zbyt wolno w stosunku do szybkości transferu tlenu, wynik może być nieprawidłowy i może wymagać nieliniowej korekty.
Dodatki do mediów mogą również zmieniać transfer tlenu w istotny sposób.Elektrolity i sole mogą tłumić koalescencję bąbelków. Pluronic F68 może zmniejszać rozmiar bąbelków. Środki przeciwpieniące często zwiększają koalescencję bąbelków, co zmniejsza efektywną powierzchnię międzyfazową i obniża kLa .
