Naprężenie ścinające może zadecydować o sukcesie lub porażce produkcji mięsa hodowanego. Dlaczego? Ponieważ używane komórki nie mają ochronnych ścian, co czyni je podatnymi na uszkodzenia spowodowane siłami płynów w bioreaktorach. Ten artykuł zagłębia się w to, jak naprężenie ścinające wpływa na te komórki, jakie progi mogą one wytrzymać i jak projektować systemy, które je chronią.
Kluczowe wnioski:
- Naprężenie ścinające powstaje w wyniku ruchu płynów i może uszkadzać delikatne komórki zwierzęce, powodując uszkodzenia błony, odłączenie lub śmierć.
- Większość komórek ssaków toleruje 0,3–1,7 Pascali, ale nawet niższe poziomy mogą aktywować reakcje stresowe.
- Wybory projektowe, takie jak typ mieszadła, metody napowietrzania i geometria bioreaktora, bezpośrednio wpływają na siły ścinające.
- Strategie minimalizacji uszkodzeń obejmują stosowanie łagodniejszych projektów bioreaktorów (e.g. , systemy podnoszenia powietrzem lub kołyszące), optymalizację prędkości mieszania i dodawanie środków ochronnych, takich jak Pluronic F68.
W przypadku mięsa hodowlanego zarządzanie tą równowagą jest kluczowe, aby zapewnić wzrost i różnicowanie komórek bez szkody, zwłaszcza gdy produkcja się zwiększa. Zbadajmy naukę stojącą za tymi progami i praktyczne rozwiązania dla projektowania bioreaktorów.
110: Obracając się jak Ziemia: Projektowanie bioreaktorów o niskim ścinaniu dla lepszej hodowli komórek z Olivierem De...
Co wpływa na naprężenie ścinające w bioreaktorach
Zrozumienie czynników wpływających na naprężenie ścinające w bioreaktorach jest kluczowe dla optymalizacji warunków, zwłaszcza gdy w grę wchodzą delikatne komórki. Zanurzmy się w główne elementy kształtujące jego intensywność i rozkład.
Projektowanie bioreaktorów i warunki operacyjne
Projekt bioreaktora odgrywa główną rolę w określaniu, gdzie i jak występuje naprężenie ścinające. Jednym z kluczowych czynników jest rodzaj mieszadła używany.Na przykład, turbiny Rushtona mogą generować szybkości rozpraszania energii do 280 razy wyższe niż średnia w naczyniu, podczas gdy wysokoefektywne wirniki osiowe, takie jak HE3, osiągają wartości bliższe 180 razy średniego rozpraszania [4]. Inne elementy konstrukcyjne, takie jak średnica wirnika, prędkość i pozycjonowanie, również wpływają na dystrybucję energii.
Co ciekawe, aeracja wprowadza znacznie surowsze siły niż mieszanie. Kiedy małe bąbelki (1–2 mm) pękają, uwalniają poziomy energii między 10⁷–10⁹ W/m³, co może zabić ponad 1 000 komórek w jednym zdarzeniu [4]. To sprawia, że zachowanie bąbelków jest kluczowym czynnikiem, zwłaszcza w produkcji mięsa hodowlanego.
Przegrody są kolejnym kluczowym elementem konstrukcyjnym. Zapobiegają one tworzeniu się wiru w kulturze, który w przeciwnym razie wciągałby bąbelki do cieczy i zwiększałby liczbę zdarzeń pękania na powierzchni [4]. Dodatkowo, stosunek średnicy wirnika do średnicy naczynia oraz wysokość wirnika od dna wpływają na to, jak energia rozprzestrzenia się w bioreaktorze.
Nierównomierne Rozłożenie Naprężeń Ścinających
Naprężenie ścinające nie jest równomiernie rozłożone w bioreaktorze. Badania pokazują, że rozpraszanie energii ma tendencję do koncentrowania się wokół określonych stref, takich jak obszar wylotu wirnika, wiry za wirnikiem oraz powierzchnia cieczy, gdzie pękają bąbelki. Te gorące punkty mogą stanowić wyzwania podczas skalowania.
Weiwei Hu z Biogen Idec podkreśla ten problem skalowania:
Postrzeganie 'wrażliwości na ścinanie' historycznie narzucało arbitralny górny limit na mieszanie i napowietrzanie w operacji bioreaktora; jednakże, wraz ze wzrostem gęstości komórek i produktywności, wymagania dotyczące przenoszenia masy mogą przekraczać te narzucone przez te arbitralnie niskie limity [4].
Na przykład, w badaniu z 2021 roku przeprowadzonym przez Junxuana Zhanga i Xuelianga Li z Uniwersytetu Jiangnan porównano kolbę obrotową o pojemności 250 mL z mieszalnikiem o objętości 20 m³, używając dynamiki płynów obliczeniowych. Zaobserwowali, że nawet przy najniższych prędkościach mieszania, siły ścinające w większym reaktorze były wystarczająco silne, aby oderwać komórki od mikronośników, a napowietrzanie wprowadzało jeszcze więcej stresu niż mieszanie [3].
Format Kultury i Wrażliwość na Ścinanie
Format kultury również determinuje, jak komórki doświadczają stresu ścinającego. Komórki hodowane na mikronośnikach są szczególnie podatne. Jeśli intensywne mieszanie lub kolizje między nośnikami powodują odrywanie się komórek, te komórki są skutecznie tracone [4]. Z drugiej strony, hodowle zawiesinowe komórek hybrydoma wykazały odporność, utrzymując żywotność przy prędkościach mieszania sięgających 1,500 RPM w bioreaktorach z przegrodami, bez interfejsu powietrze-ciecz [4].
Różne systemy hodowli radzą sobie z siłami ścinającymi na różne sposoby. Bioreaktory z łożem stałym minimalizują siły ścinające, utrzymując komórki unieruchomione na stacjonarnych powierzchniach, podczas gdy złoża fluidalne wprowadzają umiarkowane do wysokich sił ścinających poprzez ruch mikronośników i przepływ płynu w górę [2]. Niektóre mikronośniki, zwłaszcza porowate, oferują wewnętrzne powierzchnie, które mogą chronić komórki przed ekstremalnymi siłami, zapewniając lepszą ochronę w porównaniu do mikronośników stałych [2]. Te różnice podkreślają potrzebę starannego zrównoważenia dostarczania składników odżywczych z ryzykiem uszkodzenia komórek przy projektowaniu bioreaktorów.
Progi naprężeń ścinających dla różnych typów komórek
Progi tolerancji naprężeń ścinających dla typów komórek mięsa hodowanego
Zarządzanie naprężeniem ścinającym jest kluczowe dla produkcji mięsa hodowanego, ponieważ nierównomierne naprężenie może zaszkodzić komórkom, które nie mają silnych ścian komórkowych. Zrozumienie specyficznych poziomów naprężeń, które każdy typ komórki może tolerować, pomaga utrzymać zdrowie komórek, wywołać odpowiedzi mechanosensoryczne lub zachęcić do różnicowania.
Wartości progowe dla powszechnych typów komórek
Tolerancja naprężeń ścinających znacznie różni się w zależności od typu komórek, a znajomość tych progów jest kluczowa dla precyzyjnego dostosowania ustawień bioreaktora.
Na przykład, mioblasty mięsa hodowanego, takie jak linia C2C12, rozwijają się pod niskim naprężeniem ścinającym. Cykliczne naprężenie około 1,68 mPa poprawia formowanie i fuzję miotub [8] . Komórki macierzyste pochodzące z mięśni myszy (MDSCs) wykazują lepsze różnicowanie miogeniczne i bardziej rozległe formowanie miotub, gdy są narażone na 16 mPa [8] . W miarę dojrzewania mioblastów w miotuby, mogą one radzić sobie z wyższymi poziomami stresu; pulsacyjny stres pomiędzy 400 mPa a 1,400 mPa aktywuje szlaki regulujące rozmiar włókien mięśniowych, co potencjalnie prowadzi do hipertrofii [8] .
Mezenchymalne komórki macierzyste (MSCs) również reagują w unikalny sposób. Na przykład, psie MSCs narażone na naprężenie ścinające pomiędzy 100 mPa a 1,500 mPa zwiększają ekspresję markerów śródbłonkowych, takich jak PECAM-1 i VE-kadheryna, jednocześnie zmniejszając ekspresję markerów mięśni gładkich [10] .
Porównawcza tabela progów naprężenia ścinającego
Oto szybkie porównanie progów naprężenia ścinającego dla różnych typów komórek mięsa hodowlanego:
| Typ komórki | Próg naprężenia ścinającego (mPa) | Zaobserwowane efekty | Źródło |
|---|---|---|---|
| Komórki ssaków (ogólnie) | 300–1,700 | Zakres bazowy; poziomy powyżej tego mogą prowadzić do uszkodzenia komórek lub apoptozy | [1] |
| C2C12 Mioblasty (przylegające) | ~1.68 | Poprawiona żywotność i zwiększone tworzenie miotub | [8] |
| Mysie MDSC (Przylegające) | ~16 | Zwiększona różnicowanie i rozległe tworzenie miotub | [8] |
| Miotuby C2C12 (Przylegające) | 400–1,400 | Aktywacja szlaków regulujących rozmiar włókien mięśniowych (potencjalna hipertrofia) | [8] |
| Psie MSC | 100–1,500 | Wzrost ekspresji markerów śródbłonkowych, zmniejszenie markerów mięśni gładkich | [10] |
| Czujniki powierzchni komórkowej (Integryny) | 100–1,000 | Aktywacja mechanosensytywnych kanałów jonowych i receptorów | [1] |
Dla kontekstu, mieszanie kultury przy 100–200 obr./min w standardowej kolbie generuje poziomy naprężeń ścinających wynoszące 300–660 mPa, podczas gdy mieszadła orbitalne pracujące przy 20–60 obr./min wytwarzają wyższe siły w zakresie od 600 mPa do 1,600 mPa [1]. Łagodniejsze systemy, takie jak bioreaktory kołyszące (±5° przy 1 Hz), tworzą stres wynoszący około 90 mPa [9], a bioreaktory klinostatyczne działają przy około 10 mPa, pozostając znacznie poniżej progu aktywacji dla mechanosensytywnych czujników powierzchni komórek [1].
Te progi służą jako wskazówka do dostosowywania warunków w bioreaktorach, pomagając utrzymać optymalne środowiska podczas fazy skalowania i wzrostu komórek.
sbb-itb-ffee270
Jak Zredukować Uszkodzenia Spowodowane Stresem Ścinającym
Minimalizowanie uszkodzeń spowodowanych stresem ścinającym w produkcji mięsa hodowanego polega na osiągnięciu delikatnej równowagi. Celem jest zapewnienie efektywnego mieszania i dostarczania tlenu, jednocześnie chroniąc wrażliwe komórki przed uszkodzeniami mechanicznymi. Obejmuje to połączenie inteligentnego projektowania bioreaktorów i przemyślanych strategii operacyjnych.
Modyfikacje Projektu Bioreaktora
Użycie modelowania CFD (Obliczeniowa Mechanika Płynów) jest kluczowym krokiem w optymalizacji wydajności bioreaktora. Nowoczesne techniki CFD obejmują obecnie symulacje przepływu wielofazowego, które uwzględniają interakcje między komórkami a mikronośnikami. Skutkuje to dokładniejszymi ocenami naprężeń ścinających i ich potencjalnych uszkodzeń [5].
Rodzaj bioreaktora odgrywa główną rolę w określaniu poziomów naprężeń ścinających. Chociaż reaktory z mieszadłem mechanicznym są nadal szeroko stosowane, alternatywne konstrukcje mogą oferować łagodniejsze warunki:
- Bioreaktory z podnośnikiem powietrznym: Te eliminują mechaniczne mieszadła, zamiast tego używają cyrkulacji indukowanej gazem, aby zmniejszyć mechaniczne naprężenia ścinające [5].
- Bioreaktory falowe lub kołyszące: Opierając się na ruchu powierzchniowym zamiast mieszadeł, są idealne dla kultur o niskiej do średniej gęstości, które wymagają delikatnego mieszania [5].
- Bioreaktory z pionowym kołem: Szczególnie skuteczne dla kultur opartych na agregatach, wykazały sukces w utrzymaniu żywotności komórek podczas ekspansji agregatów ludzkich iPSC [11].
Innym ważnym czynnikiem jest zachowanie nienewtonowskie zawiesin komórkowych. Na przykład, zawiesiny zawierające surowicę wykazują właściwości ścinania, które tradycyjne modele często nie potrafią uchwycić. Użycie zaawansowanych modeli, takich jak model Sisko, zapewnia dokładniejsze przewidywania naprężeń ścinających, pomagając precyzyjnie dostosować siły mechaniczne i unikać progów, które mogłyby zmienić ekspresję genetyczną [6].
Metody wysiewu komórek i mieszania
Strategie operacyjne również odgrywają dużą rolę w redukcji uszkodzeń spowodowanych naprężeniem ścinającym. Na przykład, przerywane mieszanie we wczesnych etapach przyczepiania się komórek może ograniczyć narażenie na ścinanie, jednocześnie zapewniając skuteczne rozprowadzanie składników odżywczych. Dostosowanie mieszania wymaga starannego rozważenia czynników takich jak zawartość surowicy, gęstość komórek i wiek kultury [6].
Przy określaniu prędkości mieszania, modelowanie CFD może pomóc w znalezieniu idealnej równowagi - wystarczającego transferu tlenu bez powodowania uszkodzeń mechanicznych. Symulacje podzielone na segmenty mogą dodatkowo udoskonalić rozkład naprężeń ścinających, czyniąc proces bardziej efektywnym [5].
Wpływ na projektowanie i skalowanie bioreaktorów
Podczas skalowania bioreaktorów do produkcji mięsa hodowlanego, zrozumienie i zastosowanie progów naprężeń ścinających jest kluczowe. Te progi wpływają na decyzje dotyczące prędkości mieszadła, konstrukcji dyfuzora i innych parametrów, aby zapewnić żywotność komórek wraz ze wzrostem wolumenu produkcji.
Ustalanie parametrów operacyjnych bioreaktora
Progi naprężeń ścinających odgrywają kluczową rolę w definiowaniu granic operacyjnych. Na przykład, hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) mają próg wynoszący około 0.092 Pa[12]. Pozostawanie poniżej tego poziomu - na przykład działanie przy 50 obr./min, co generuje około 0.068 Pa - wspiera zdrową ekspansję komórek, osiągając 27.4-krotny wzrost. Jednak zwiększenie mieszania do 100 obr./min zwiększa naprężenie ścinające do około 0.192 Pa, co skutkuje 72% wskaźnikiem apoptozy i ogranicza ekspansję do 24.5‐fold[12].
"Próg naprężenia ścinającego dla proliferacji i funkcji HSCs wynosi 0,092 Pa." – Hosseinizand et al. [12]
Uszkodzenia ścinające występują, gdy wiry turbulentne stają się mniejsze niż około dwie trzecie średnicy komórki lub agregatu[12][13]. Przy 50 obr./min wiry mają około 280 µm, co jest bezpieczne dla komórek. Ale przy 100 obr./min wiry kurczą się do 166 µm, zwiększając ryzyko uszkodzeń mechanicznych.
Sparging wprowadza dodatkowy stres hydrodynamiczny. Małe bąbelki (średnica 1 mm) generują lokalne prędkości płynu około 6,4 m/s podczas pękania, podczas gdy większe bąbelki o średnicy 6 mm wytwarzają łagodniejsze szczyty o wartości 0,94 m/s[13]. Aby temu przeciwdziałać, stosuje się dodatki takie jak Pluronic F68, aby zapobiec przywieraniu komórek do powierzchni bąbelków.Jednak ich skuteczność zależy od utrzymania odpowiedniego stężenia w stosunku do powierzchni gazu [13].
Te parametry są kluczowe przy przechodzeniu do większych systemów bioreaktorów.
Utrzymanie warunków podczas zwiększania skali
Zwiększanie skali z kolby obrotowej o pojemności 250 mL do reaktora zbiornikowego o pojemności 20 m³ wprowadza unikalne wyzwania. Warunki hydrodynamiczne w systemach małej skali nie przekładają się bezpośrednio na objętości przemysłowe. Nawet operowanie dużymi reaktorami przy minimalnych prędkościach mieszania może skutkować siłami ścinającymi wystarczająco silnymi, aby oderwać komórki od mikronośników[3].
"Nawet przy pracy z prędkością mieszania bliską Njs, same siły ścinające wywierane przez mieszadła mogą powodować odrywanie komórek od mikronośników, a jeszcze większy stres hydrodynamiczny wprowadzany jest przez napowietrzanie." – Zhang et al.[3]
Aby utrzymać spójne warunki ścinania podczas skali, jednym z podejść jest utrzymanie stałej prędkości końcówki mieszadła. Jednakże, może to prowadzić do dłuższych czasów mieszania oraz powstawania gradientów składników odżywczych i tlenu, co może negatywnie wpływać na wzrost i wydajność komórek[3]. Modelowanie obliczeniowej dynamiki płynów (CFD) staje się niezbędne do identyfikacji stref stresu i optymalizacji projektu reaktora podczas skali[5].
Dla linii komórkowych, które są bardzo wrażliwe na ścinanie, alternatywne projekty reaktorów są często bardziej odpowiednie. Reaktory airlift, które eliminują mechaniczne mieszadła, zostały pomyślnie zamodelowane dla objętości do 300 000 L, osiągając teoretyczne gęstości komórek 2 × 10⁸ komórek/mL[7]. Podobnie, bioreaktory kołyszące wykorzystują delikatne ruchy falowe, aby zminimalizować ścinanie, co czyni je skutecznymi dla linii nasiennych do 500 L[14][15]. Platformy takie jak
Podsumowanie i rekomendacje
Skuteczne zarządzanie stresem ścinającym jest kluczowe dla utrzymania żywotności komórek i produktywności w produkcji mięsa hodowlanego. Badania pokazują, że pękanie bąbelków podczas napowietrzania tworzy bardziej szkodliwe siły niż mechaniczne mieszanie. Na przykład, małe bąbelki (1 mm) generują prędkości płynów wynoszące 6,4 m/s po pęknięciu, podczas gdy większe bąbelki (6 mm) wytwarzają łagodniejsze szczyty o wartości 0,94 m/s [13]. Aby zminimalizować te siły, zespoły ds. zaopatrzenia powinny skupić się na bioreaktorach wyposażonych w spiekane mikrospargery (wielkość porów 15 μm), które umożliwiają pulsacyjną aerację i redukują interfejs gaz-ciecz. Te rozważania są kluczowe dla skalowania systemów bioreaktorów.
Innym ważnym czynnikiem jest stosunek skali wiru do średnicy komórki (η/d_c), który może pomóc zmniejszyć uszkodzenia spowodowane mieszaniem. Badanie przeprowadzone w sierpniu 2017 roku przez Instytut Inżynierii Bioprocesowej i Technologii Farmaceutycznej to podkreśla. Używając 3-litrowego Applikon szklanego bioreaktora z komórkami owadzimi Sf21, wykazali, że sześciopłatowe mieszadło Rushtona przy 205 obr./min, w połączeniu z bąbelkami o wielkości 199 μm, wyprodukowało wydajność białka GFP na poziomie 12,75 μg/mL. Natomiast mieszadło z łopatkami nachylonymi przy 171 obr./min, które generowało większą specyficzną powierzchnię gazu wynoszącą 18,0 m²/m³, dało tylko 4,0 μg/mL [13]. To pokazuje, że całkowita powierzchnia gazu jest bardziej wpływowa niż prędkość mieszania.
Środki ochronne, takie jak Pluronic F68 (0,5–3 g/L), mogą tworzyć 16–40 μm warstwę ochronną wokół pęcherzyków, zapobiegając przyczepianiu się komórek [13]. Jednak, jak zaobserwowali Tobias Weidner i współpracownicy:
Jeśli [całkowita powierzchnia gazu] przekracza pewien próg, stężenie Pluronic nie jest już wystarczające do ochrony komórek [13].
Oznacza to, że inżynierowie muszą starannie monitorować powierzchnię gazu w odniesieniu do stężenia Pluronic F68 podczas skalowania, aby zapewnić ochronę komórek.
Dla wrażliwych linii komórkowych alternatywne projekty reaktorów mogą stanowić rozwiązanie. Reaktory airlift, na przykład, eliminują mechaniczne mieszadła, tworząc łagodniejsze środowisko mieszania [7]. Bioreaktory z łożem stałym są inną opcją, zdolną do utrzymania ultra-niskich naprężeń ścinających ścian w zakresie od 10⁻³ do 10⁻² Pa [17]. Dla zespołów badających specjalistyczne systemy o niskim ścinaniu, dostawcy tacy jak
Dodatkowo, utrzymanie mioblastów bydlęcych poniżej 25 podwojeń populacji jest kluczowe dla zachowania ich zdolności do różnicowania [16]. Przekroczenie tego progu może prowadzić do zmniejszenia indeksu fuzji o około 6,81% z każdym przejściem [16], zmniejszając zdolność komórek do tworzenia włókien mięśniowych. Aby temu zaradzić, inżynierowie procesowi powinni wykorzystać modelowanie obliczeniowej dynamiki płynów (CFD) do identyfikacji stref o wysokim ścinaniu przed skalowaniem z systemów laboratoryjnych do przemysłowych. Takie podejście zapewnia płynniejsze przejścia i lepsze wyniki podczas skalowania.
FAQs
Jak zmierzyć naprężenie ścinające w moim bioreaktorze?
Naprężenie ścinające w bioreaktorach jest często oceniane przy użyciu technik modelowania obliczeniowego takich jak obliczeniowa dynamika płynów (CFD). Metody te pozwalają na analizę wzorców przepływu i identyfikację stref ścinania w bioreaktorze. Dodatkowo, narzędzia do testowania ścinania w małej skali są wartościowe do charakteryzowania wrażliwości określonych linii komórkowych i oceny różnych warunków procesowych. Do ciągłego monitorowania naprężenie ścinające można określić poprzez obliczenie prędkości płynu i lepkości. Podejście to jest szczególnie skuteczne w systemach mikroprzepływowych lub przy wykorzystaniu kalkulatorów naprężenia ścinającego online.
Jaka metoda napowietrzania minimalizuje uszkodzenia spowodowane pękaniem bąbelków?
Minimalizacja uszkodzeń spowodowanych pękaniem bąbelków w dużej mierze zależy od użycia mniejszych bąbelków. Te bąbelki powodują mniejsze uszkodzenia komórek w porównaniu na zasadzie objętość do objętości.Chociaż dokładne techniki nie są opisane, zarządzanie wielkością i zachowaniem pęcherzyków - jak regulacja ich wielkości - odgrywa kluczową rolę w zmniejszaniu szkodliwych skutków pęknięcia.
Co powinienem utrzymać na stałym poziomie podczas skalowania, aby zmniejszyć ścinanie?
Podczas zwiększania rozmiaru bioreaktorów do hodowli mięsa, kluczowe jest utrzymanie naprężenia ścinającego poniżej około 3 Pa, aby zapobiec uszkodzeniu komórek. Zwróć szczególną uwagę na czynniki takie jak mieszanie, wzorce przepływu, i aeracja , aby zapewnić, że poziomy ścinania pozostaną spójne przez cały czas operacji.
