La contrainte de cisaillement peut faire ou défaire la production de viande cultivée. Pourquoi ? Parce que les cellules utilisées manquent de parois protectrices, ce qui les rend sujettes aux dommages causés par les forces fluides dans les bioréacteurs. Cet article explore comment la contrainte de cisaillement affecte ces cellules, les seuils qu'elles peuvent supporter et les moyens de concevoir des systèmes qui les protègent.
Points clés à retenir :
- La contrainte de cisaillement provient du mouvement des fluides et peut nuire aux cellules animales fragiles, causant des dommages à la membrane, un détachement ou la mort.
- La plupart des cellules de mammifères tolèrent 0,3–1,7 Pascals, mais même des niveaux inférieurs peuvent activer des réponses au stress.
- Les choix de conception comme le type d'agitateur, les méthodes d'aération et la géométrie du bioréacteur ont un impact direct sur les forces de cisaillement.
- Les stratégies pour minimiser les dommages incluent l'utilisation de conceptions de bioréacteurs plus douces (e.g. , systèmes à circulation d'air ou à bascule), l'optimisation des vitesses d'agitation et l'ajout d'agents protecteurs comme Pluronic F68.
Pour la viande cultivée, gérer cet équilibre est crucial pour garantir que les cellules se développent et se différencient sans dommage, surtout à mesure que la production s'intensifie. Explorons la science derrière ces seuils et les solutions pratiques pour la conception de bioréacteurs.
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Ce qui affecte le stress de cisaillement dans les bioréacteurs
Comprendre les facteurs qui influencent le stress de cisaillement dans les bioréacteurs est crucial pour optimiser les conditions, surtout lorsque des cellules délicates sont impliquées. Plongeons dans les principaux éléments qui façonnent son intensité et sa distribution.
Conception et conditions de fonctionnement des bioréacteurs
La conception d'un bioréacteur joue un rôle majeur dans la détermination de l'endroit et de la manière dont le stress de cisaillement se produit. Un facteur clé est le type d'hélice utilisé.Par exemple, les turbines Rushton peuvent créer des taux de dissipation d'énergie jusqu'à 280 fois supérieurs à la moyenne du récipient, tandis que les hélices à flux axial à haute efficacité comme le HE3 produisent des taux plus proches de 180 fois la dissipation moyenne [4]. D'autres éléments de conception, tels que le diamètre de l'hélice, la vitesse et le positionnement, influencent également la distribution de l'énergie.
Il est intéressant de noter que l'aération introduit des forces beaucoup plus sévères que l'agitation. Lorsque de petites bulles (1–2 mm) éclatent, elles libèrent des niveaux d'énergie entre 10⁷–10⁹ W/m³, ce qui peut tuer plus de 1 000 cellules en un seul événement [4]. Cela rend le comportement des bulles une considération critique, surtout dans la production de viande cultivée.
Les déflecteurs sont un autre élément clé de conception. Ils empêchent la formation d'un vortex dans la culture, qui autrement attirerait les bulles dans le liquide et augmenterait les événements de rupture à la surface [4]. De plus, le rapport du diamètre de l'impulseur au récipient et la hauteur de l'impulseur par rapport au fond influencent la manière dont l'énergie se répartit dans le bioréacteur.
Répartition Inégale du Stress de Cisaillement
Le stress de cisaillement n'est pas réparti uniformément dans le bioréacteur. Les recherches montrent que la dissipation d'énergie a tendance à se concentrer autour de zones spécifiques, telles que la zone de décharge de l'impulseur, les tourbillons traînants et la surface liquide où les bulles éclatent. Ces points chauds peuvent poser des défis lors de l'augmentation d'échelle.
Weiwei Hu de Biogen Idec souligne ce problème d'échelle :
La perception de la 'sensibilité au cisaillement' a historiquement imposé une limite supérieure arbitraire à l'agitation et à l'aération dans le fonctionnement des bioréacteurs ; cependant, à mesure que les densités cellulaires et les productivités continuent d'augmenter, les exigences de transfert de masse peuvent dépasser celles imposées par ces limites arbitrairement basses [4].
Par exemple, une étude de 2021 menée par Junxuan Zhang et Xueliang Li de l'Université de Jiangnan a comparé un flacon agitateur de 250 mL avec un réacteur à cuve agitée de 20 m³ en utilisant la dynamique des fluides computationnelle. Ils ont observé que même aux vitesses d'agitation les plus basses, les forces de cisaillement dans le réacteur plus grand étaient suffisamment fortes pour détacher les cellules des microporteurs, le barbotage introduisant encore plus de stress que l'agitation [3].
Format de Culture et Sensibilité au Cisaillement
Le format de culture détermine également comment les cellules subissent le stress de cisaillement. Les cellules cultivées sur des microporteurs sont particulièrement vulnérables. Si un mélange intense ou des collisions entre les porteurs provoquent le détachement des cellules, ces cellules sont effectivement perdues [4]. D'autre part, les cultures en suspension de cellules hybridomes ont démontré une résilience, maintenant leur viabilité à des vitesses d'agitation allant jusqu'à 1 500 RPM dans des bioréacteurs à chicanes sans interface air-liquide [4].
Différents systèmes de culture gèrent le cisaillement de diverses manières. Les bioréacteurs à lit fixe minimisent le cisaillement en gardant les cellules immobilisées sur des surfaces stationnaires, tandis que les lits fluidisés introduisent un cisaillement modéré à élevé par le mouvement des microporteurs et le flux ascendant de fluide [2]. Certains microporteurs, en particulier les poreux, offrent des surfaces internes qui peuvent protéger les cellules des forces extrêmes, offrant une meilleure protection par rapport aux microporteurs solides [2]. Ces différences soulignent la nécessité de bien équilibrer l'apport en nutriments avec le risque de dommages cellulaires lors de la conception des bioréacteurs.
Seuils de contrainte de cisaillement pour différents types de cellules
Seuils de tolérance au cisaillement pour les types de cellules de viande cultivée
Gérer le cisaillement est crucial pour la production de viande cultivée, car un stress inégal peut nuire aux cellules qui manquent de parois cellulaires solides. Comprendre les niveaux de stress spécifiques que chaque type de cellule peut tolérer aide à maintenir la santé cellulaire, à déclencher des réponses mécanoréceptives ou à encourager la différenciation.
Valeurs seuils pour les types de cellules courants
La tolérance au cisaillement varie considérablement entre les types de cellules, et connaître ces seuils est essentiel pour affiner les réglages des bioréacteurs.
Par exemple, les myoblastes de viande cultivée comme la lignée C2C12 prospèrent sous un faible cisaillement. Un stress cyclique d'environ 1,68 mPa améliore la formation et la fusion des myotubes [8] . Les cellules souches dérivées des muscles de souris (MDSCs) montrent une meilleure différenciation myogénique et une formation de myotubes plus étendue lorsqu'elles sont exposées à 16 mPa [8] . À mesure que les myoblastes mûrissent en myotubes, ils peuvent supporter des niveaux de stress plus élevés ; un stress pulsé entre 400 mPa et 1,400 mPa active des voies qui régulent la taille des fibres musculaires, pouvant potentiellement conduire à l'hypertrophie [8] .
Les cellules souches mésenchymateuses (MSCs) réagissent également de manière unique. Par exemple, les MSCs canines exposées à un stress de cisaillement entre 100 mPa et 1,500 mPa régulent à la hausse les marqueurs endothéliaux comme PECAM-1 et VE-cadhérine tout en régulant à la baisse les marqueurs de muscle lisse [10] .
Tableau de comparaison des seuils de contrainte de cisaillement
Voici une comparaison rapide des seuils de contrainte de cisaillement pour différents types de cellules de viande cultivée :
| Type de cellule | Seuil de contrainte de cisaillement (mPa) | Effets observés | Source |
|---|---|---|---|
| Cellules mammifères (général) | 300–1,700 | Plage de base ; des niveaux au-dessus peuvent entraîner des dommages cellulaires ou l'apoptose | [1] |
| Myoblastes C2C12 (adhérents) | ~1.68 | Viabilité améliorée et formation accrue de myotubes | [8] |
| MDSCs de souris (Adhérentes) | ~16 | Différenciation améliorée et formation extensive de myotubes | [8] |
| Myotubes C2C12 (Adhérentes) | 400–1,400 | Activation des voies régulant la taille des fibres musculaires (hypertrophie potentielle) | [8] |
| MSCs canines | 100–1,500 | Régulation positive des marqueurs endothéliaux, réduction des marqueurs de muscle lisse | [10] |
| Capteurs de surface cellulaire (Intégrines) | 100–1,000 | Activation des canaux ioniques et récepteurs mécanorécepteurs | [1] |
Pour contexte, agiter une culture à 100–200 tr/min dans un flacon standard génère des niveaux de contrainte de cisaillement de 300–660 mPa, tandis que les agitateurs orbitaux fonctionnant à 20–60 tr/min produisent des forces plus élevées allant de 600 mPa à 1,600 mPa [1]. Des systèmes plus doux comme les bioréacteurs oscillants (±5° à 1 Hz) créent un stress d'environ 90 mPa [9], et les bioréacteurs clinostats fonctionnent à environ 10 mPa, restant bien en dessous du seuil d'activation pour les capteurs de surface cellulaire mécanorécepteurs [1].
Ces seuils servent de guide pour ajuster les conditions des bioréacteurs, aidant à maintenir des environnements optimaux pendant les phases de montée en échelle et de croissance cellulaire.
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Comment Réduire les Dégâts dus au Stress de Cisaillement
Minimiser les dégâts dus au stress de cisaillement dans la production de viande cultivée consiste à atteindre un équilibre délicat. L'objectif est d'assurer un mélange efficace et une livraison d'oxygène tout en protégeant les cellules sensibles des dommages mécaniques. Cela implique une combinaison de conception intelligente de bioréacteurs et de stratégies opérationnelles réfléchies.
Modifications de Conception de Bioréacteur
L'utilisation de la modélisation CFD (Dynamique des Fluides Numérique) est une étape clé dans l'optimisation des performances des bioréacteurs. Les techniques CFD modernes incluent désormais des simulations d'écoulement multiphasique, qui prennent en compte les interactions entre les cellules et les microporteurs. Cela permet des évaluations plus précises du stress de cisaillement et de ses dommages potentiels [5].
Le type de bioréacteur joue un rôle majeur dans la détermination des niveaux de stress de cisaillement. Bien que les réacteurs à cuve agitée soient encore largement utilisés, des conceptions alternatives peuvent offrir des conditions plus douces:
- Bioréacteurs à circulation d'air: Ceux-ci éliminent les agitateurs mécaniques, utilisant à la place une circulation induite par le gaz pour réduire le cisaillement mécanique [5].
- Bioreacteurs à vagues ou à bascule: En s'appuyant sur le mouvement de surface au lieu des turbines, ceux-ci sont idéaux pour les cultures de densité faible à moyenne nécessitant un mélange doux [5].
- Bioreacteurs à roue verticale: Particulièrement efficaces pour les cultures basées sur des agrégats, ceux-ci ont montré du succès dans le maintien de la viabilité cellulaire lors de l'expansion des agrégats de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) [11].
Un autre facteur important est le comportement non-newtonien des suspensions cellulaires. Par exemple, les suspensions contenant du sérum présentent des propriétés d'amincissement par cisaillement, que les modèles traditionnels échouent souvent à capturer. L'utilisation de modèles avancés, comme le modèle de Sisko, fournit des prédictions plus précises du stress de cisaillement, aidant à affiner les forces mécaniques et à éviter les seuils qui pourraient altérer l'expression génétique [6].
Méthodes de Semis Cellulaire et d'Agitation
Les stratégies opérationnelles jouent également un rôle important dans la réduction des dommages dus au stress de cisaillement. Par exemple, l'agitation intermittente pendant les premières étapes de l'attachement cellulaire peut limiter l'exposition au cisaillement tout en assurant une distribution efficace des nutriments. L'ajustement de l'agitation nécessite une considération attentive de facteurs tels que la teneur en sérum, la densité cellulaire et l'âge de la culture [6].
Lors de la détermination des vitesses d'agitation, la modélisation CFD peut aider à identifier l'équilibre idéal - un transfert d'oxygène suffisant sans causer de dommages mécaniques. Des simulations compartimentées peuvent affiner davantage la distribution du stress de cisaillement, rendant le processus plus efficace [5].
Impact sur la Conception et l'Échelle des Bioréacteurs
Lors de l'augmentation de l'échelle des bioréacteurs pour la production de viande cultivée, comprendre et appliquer les seuils de contrainte de cisaillement est crucial. Ces seuils influencent les décisions sur la vitesse de l'agitateur, la conception du diffuseur et d'autres paramètres pour assurer la viabilité cellulaire à mesure que les volumes de production augmentent.
Définition des Paramètres de Fonctionnement des Bioréacteurs
Les seuils de contrainte de cisaillement jouent un rôle clé dans la définition des limites opérationnelles. Par exemple, les cellules souches hématopoïétiques (CSH) ont un seuil d'environ 0,092 Pa[12]. Rester en dessous de ce niveau - comme fonctionner à 50 tr/min, ce qui génère environ 0,068 Pa - soutient une expansion cellulaire saine, atteignant une augmentation de 27,4 fois. Cependant, augmenter l'agitation à 100 tr/min augmente la contrainte de cisaillement à environ 0,192 Pa, entraînant un taux d'apoptose de 72% et limitant l'expansion à 24.5‐fold[12].
"Le seuil de contrainte de cisaillement pour la prolifération et la fonction des HSCs a été rapporté à 0,092 Pa." – Hosseinizand et al. [12]
Les dommages de cisaillement se produisent lorsque les tourbillons turbulents deviennent plus petits qu'environ les deux tiers du diamètre d'une cellule ou d'un agrégat[12][13]. À 50 tr/min, les tourbillons mesurent environ 280 µm, ce qui est sans danger pour les cellules. Mais à 100 tr/min, les tourbillons rétrécissent à 166 µm, augmentant le risque de dommages mécaniques.
Le barbotage introduit un stress hydrodynamique supplémentaire. Les petites bulles (1 mm de diamètre) génèrent des vitesses de fluide locales d'environ 6,4 m/s lors de la rupture, tandis que les bulles plus grandes de 6 mm produisent des pics plus doux de 0,94 m/s[13]. Pour contrer cela, des additifs comme le Pluronic F68 sont utilisés pour empêcher les cellules de coller aux surfaces des bulles.Cependant, leur efficacité dépend du maintien de la bonne concentration par rapport à la surface du gaz [13].
Ces paramètres sont essentiels lors de la transition vers des systèmes de bioréacteurs plus grands.
Maintien des conditions lors de la montée en échelle
Passer d'un flacon agitateur de 250 mL à un réacteur à cuve agitée de 20 m³ présente des défis uniques. Les conditions hydrodynamiques dans les systèmes à petite échelle ne se traduisent pas directement en volumes industriels. Même l'exploitation de grands réacteurs à des vitesses d'agitation minimales peut entraîner des forces de cisaillement suffisamment fortes pour détacher les cellules des microporteurs[3].
"Même lorsqu'il est exploité à une vitesse d'agitation proche du Njs, le cisaillement exercé par les turbines seules pourrait provoquer le détachement des cellules des microporteurs, tandis qu'un stress hydrodynamique encore plus important est introduit via le barbotage." – Zhang et al.[3]
Pour maintenir des conditions de cisaillement constantes lors de l'augmentation d'échelle, une approche consiste à garder la vitesse de pointe de l'hélice constante. Cependant, cela peut entraîner des temps de mélange plus longs et la formation de gradients de nutriments et d'oxygène, ce qui peut affecter négativement la croissance et la performance des cellules[3]. La modélisation par dynamique des fluides computationnelle (CFD) devient essentielle pour identifier les zones de stress et optimiser la conception du réacteur lors de l'augmentation d'échelle[5].
Pour les lignées cellulaires très sensibles au cisaillement, des conceptions de réacteurs alternatives sont souvent plus adaptées. Les réacteurs à circulation d'air, qui éliminent les agitateurs mécaniques, ont été modélisés avec succès pour des volumes allant jusqu'à 300 000 L, atteignant des densités cellulaires théoriques de 2 × 10⁸ cellules/mL[7]. De même, les bioréacteurs à bascule utilisent des mouvements ondulatoires doux pour minimiser le cisaillement, les rendant efficaces pour les chaînes de semences jusqu'à 500 L[14][15]. Des plateformes comme
Résumé et Recommandations
Gérer efficacement le stress de cisaillement est crucial pour maintenir la viabilité et la productivité des cellules dans la production de viande cultivée. Les recherches montrent que la rupture des bulles lors de l'aération crée des forces plus dommageables que l'agitation mécanique. Par exemple, de petites bulles (1 mm) génèrent des vitesses de fluide de 6,4 m/s lors de la rupture, tandis que de plus grandes bulles (6 mm) produisent des pics plus doux de 0,94 m/s [13]. Pour minimiser ces forces, les équipes d'approvisionnement devraient se concentrer sur les bioréacteurs équipés de microspargeurs frittés (taille de pore de 15 μm), qui permettent une aération pulsée et réduisent l'interface gaz-liquide. Ces considérations sont essentielles pour l'augmentation d'échelle des systèmes de bioréacteurs.
Un autre facteur important est le rapport de l'échelle des tourbillons au diamètre des cellules (η/d_c), qui peut aider à réduire les dommages causés par l'agitation. Une étude menée en août 2017 par l'Institut de Génie des Bioprocédés et de Technologie Pharmaceutique le souligne. En utilisant un bioréacteur en verre Applikon de 3 L avec des cellules d'insectes Sf21, ils ont montré qu'un agitateur Rushton à six pales à 205 tr/min, combiné avec des bulles de 199 μm, produisait un rendement en protéine GFP de 12,75 μg/mL. En revanche, un agitateur à pales inclinées à 171 tr/min, qui générait une surface spécifique de gaz plus élevée de 18,0 m²/m³, ne produisait que 4,0 μg/mL [13]. Cela démontre que la surface totale de gaz est plus influente que la vitesse d'agitation.
Les agents protecteurs tels que le Pluronic F68 (0,5–3 g/L) peuvent former une couche protectrice de 16–40 μm autour des bulles, empêchant les cellules de s'attacher [13]. Cependant, comme l'ont observé Tobias Weidner et ses collègues :
Si la surface [totale de gaz] dépasse un certain seuil, la concentration de Pluronic n'est plus suffisante pour la protection des cellules [13].
Cela signifie que les ingénieurs doivent surveiller attentivement la surface de gaz par rapport à la concentration de Pluronic F68 lors de l'augmentation d'échelle pour garantir que les cellules restent protégées.
Pour les lignées cellulaires sensibles, des conceptions de réacteurs alternatives peuvent offrir des solutions. Les réacteurs à circulation d'air, par exemple, éliminent les agitateurs mécaniques, créant un environnement de mélange plus doux [7]. Les bioréacteurs à lit fixe sont une autre option, capables de maintenir des contraintes de cisaillement ultra-faibles allant de 10⁻³ à 10⁻² Pa [17]. Pour les équipes explorant des systèmes spécialisés à faible cisaillement, des fournisseurs comme
De plus, maintenir les myoblastes bovins en dessous de 25 dédoublements de population est essentiel pour préserver leur capacité de différenciation [16]. Dépasser ce seuil peut entraîner une diminution de l'indice de fusion d'environ 6,81 % à chaque passage [16], réduisant la capacité des cellules à former des fibres musculaires. Pour y remédier, les ingénieurs de procédé devraient utiliser la modélisation par dynamique des fluides computationnelle (CFD) pour identifier les zones de cisaillement élevé avant de passer de systèmes de laboratoire à des systèmes industriels. Cette approche assure des transitions plus fluides et de meilleurs résultats lors de la montée en échelle.
FAQ
Comment mesurer le stress de cisaillement dans mon bioréacteur ?
Le stress de cisaillement dans les bioréacteurs est souvent évalué à l'aide de techniques de modélisation computationnelle comme la dynamique des fluides computationnelle (CFD). Ces méthodes permettent l'analyse des schémas d'écoulement et l'identification des zones de cisaillement au sein du bioréacteur. De plus, les outils de test de cisaillement à petite échelle sont précieux pour caractériser la sensibilité de certaines lignées cellulaires et pour évaluer diverses conditions de processus. Pour une surveillance continue, le stress de cisaillement peut être déterminé en calculant la vitesse et la viscosité du fluide. Cette approche est particulièrement efficace dans les systèmes microfluidiques ou en utilisant des calculateurs de stress de cisaillement en ligne.
Quelle méthode d'aération minimise les dommages causés par la rupture des bulles ?
Minimiser les dommages causés par la rupture des bulles repose fortement sur l'utilisation de bulles plus petites. Ces bulles causent moins de dommages cellulaires lorsqu'elles sont comparées sur une base volume à volume.Bien que les techniques exactes ne soient pas décrites, gérer la taille et le comportement des bulles - comme réguler leur taille - joue un rôle crucial dans la réduction des effets nocifs de la rupture.
Que dois-je garder constant lors de l'augmentation de l'échelle pour réduire le cisaillement ?
Lors de l'augmentation de la taille des bioréacteurs de viande cultivée, il est crucial de maintenir la contrainte de cisaillement en dessous d'environ 3 Pa pour éviter de nuire aux cellules. Portez une attention particulière à des facteurs tels que l'agitation, les schémas d'écoulement, et l'aération pour garantir que les niveaux de cisaillement restent constants tout au long de l'opération.
